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目的:本课题主要研究宫颈癌Caski细胞中PD-L1的高表达与HPV16E7的相关性;并探讨通过sPD-1阻断PD-1/PD-L1信号途径,以及协同HPV16E7基因对肿瘤的特异性杀伤淋巴细胞发生抑制作用的影响时,使肿瘤特异性淋巴细胞的生物学功能得以恢复的功能作用。 方法:(1)利用流式细胞术检测本实验室已建立的稳转细胞株PC3-E7中PD-L1的表达水平。(2)利用PCR技术克隆获得人sPD-1的目的基因,并构建真核表达质粒MSCVPIG-sPD-1。(3)将鉴定构建成功的真核表达质粒MSCVPIG-sPD-1转染人宫颈癌Caski细胞,通过嘌呤霉素筛选出阳性克隆,并进行扩大培养后,利用Western blot、RT-PCR及免疫荧光技术鉴定sPD-1在Caski细胞中的稳定表达。(4)使稳转MSCVPIG-sPD-1的克隆细胞与从人脐带血分离得到的淋巴细胞混合共培养后,利用RT-PCR、FCM、LDH杀伤活性测定来检测共培养的淋巴细胞的增殖能力及CTL和NK杀伤活性。以转染空载质粒组为阴性对照。(5)利用FCM检测淋巴细胞与稳转细胞株PC3-E7混合共培养后,其增殖及杀伤活性的抑制作用,进一步探讨sPD-1恢复HPV16E7对肿瘤特异性T细胞的抑制作用。 结果:(1)利用流式细胞术检测本实验室已建立的稳转细胞株PC3-E7中PD-L1明显高表达于对照组。(2)成功克隆并构建真核表达载体MSCVPIG-sPD-1质粒,经酶切和测序鉴定完全正确。(3)将构建好的真核表达质粒MSCVPIG-sPD-1转染人宫颈癌Caski细胞,并经过嘌呤霉素的筛选阳性克隆,经过扩大培养后,利用western blot、RT-PCR及免疫荧光鉴定成功获得MSCVPIG-sPD-1稳定克隆细胞株。(4)利用RT-PCR、FCM、LDH杀伤活性测定检测与MSCVPIG-sPD-1稳转细胞混合共培养的人淋巴细胞较阴性对照组明显增强淋巴细胞细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-10表达量明显增多,淋巴细胞的增殖能力及杀伤活性都显著增加。(5)利用FCM检测淋巴细胞与稳转细胞株PC3-3.1(-)-E7混合共培养,淋巴细胞的增殖活性较阴性对照组显著抑制。将转入sPD-1基因的PC3-3.1(-)-E7克隆细胞与淋巴细胞共培养时发现,HPV16E7对淋巴细胞生物活性的抑制作用得以逆转。 结论:HPV16E7上调PD-L1表达是宫颈癌免疫逃逸机制之一,将稳定转染了可溶性PD-1基因的Caski细胞与人淋巴细胞共培养,发现淋巴细胞的增殖能力及CTL及NK杀伤活性明显增强,而HPV16E7可使人淋巴细胞增殖能力及CTL及NK杀伤活性受到抑制,由此推断,可溶性PD-1可恢复因HPV16E7癌基因对肿瘤特异性T淋巴细胞生物活性的抑制作用,改善T细胞免疫功能缺陷,避免使肿瘤细胞逃脱机体免疫监控,促进肿瘤免疫治疗效果。利用可溶性PD-1阻断PD-L1/PD-1信号途径后可有望为宫颈癌分子免疫治疗提供新的策略。