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随着我国人口老龄化问题的日益严重，缺血性脑中风的发生率日渐增加，但因为溶栓药物的治疗时间窗较窄及其副作用，仅有少部分患者接受溶栓治疗，因而寻求更好的预防治疗手段成为研究热点。大量研究证实，电针预处理可以诱导脑缺血耐受效应，减轻脑缺血损伤，但其脑保护的相关机制尚未得到完整阐明。低氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）在缺血后神经细胞凋亡及微循环的重建等方面发挥重要调控作用，HIF-1α及其下游基因产物在脑缺血损伤中的保护作用已被广泛关注，但其在电针预处理脑保护中的作用及上下游调控机制尚不清楚。本课题应用大鼠大脑中动脉阻闭模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模拟局灶性脑缺血损伤，研究HIF-1α在电针预处理诱导脑缺血保护效应中的作用及其机制，并对HIF-1α与Notch信号通路在脑缺血损伤中的相互作用关系进行探讨，以期阐明电针预处理的脑缺血保护机制，为电针预处理的临床应用提供新的理论依据。第一部分观察电针预处理对缺血再灌注前后HIF-1α的影响目的：1.研究缺血再灌注损伤对HIF-1α表达的影响。2.研究电针预处理对缺血再灌注前后HIF-1α表达的影响。方法：雄性SD大鼠96只，体重280~320g，随机分为两组（n=48）：对照组（CON）和电针预处理组（EA），CON组动物仅建立MCAO模型（n=40），EA组动物接受连续5d电针刺激，每次30min，最后一次电针刺激后24h建立MCAO模型（n=40），分别于最后一次电针刺激后24h和缺血再灌注后2h，6h，24h，48h及72h处死大鼠取缺血半暗带脑组织（n=8），Realtime PCR(RT-PCR)检测缺血半暗带中HIF-1α及HO-1mRNA水平，Western Blot检测缺血半暗带中HIF-1α蛋白表达情况，应用免疫荧光双标染色定位观察HIF-1α在脑内细胞分布情况。结果：1. RT-PCR检测显示：缺血再灌注前，CON与EA组中HIF-1α及下游靶基因HO-1mRNA水平差异无统计学意义；缺血再灌注后，EA组HIF-1α及HO-1mRNA水平在再灌注后2h，6h及24h均显著高于CON组(P<0.05)，再灌注后48h及72h显著低于CON组(P<0.05)。2. Western Blot检测显示：EA组HIF-1α蛋白表达在再灌注后2h较再灌注前显著升高(P<0.05，与缺血再灌注前比较)，并于再灌注后48h达到峰值，再灌注后2h，6h，24h及48h，EA组HIF-1α蛋白表达均显著高于CON组(P<0.05，与对照组比较)。3.免疫荧光双标染色显示：HIF-1α阳性信号与神经元标记物NeuN阳性信号存在共定位。缺血再灌注后24h，EA组HIF-1α阳性细胞及NeuN阳性细胞均显著多于CON组(P<0.05)，EA组缺血半暗带中HIF-1α/NeuN双标神经元细胞数量也显著多于CON组(P<0.05)。结论：电针预处理能显著上调缺血再灌注后缺血半暗带中HIF-1α表达，且HIF-1α表达于缺血后神经元细胞之上。第二部分观察抑制HIF-1α表达对电针预处理诱导脑缺血保护的影响目的：1.研究HIF-1α抑制剂2ME2对电针预处理诱导脑缺血保护的影响。2.探讨HIF-1α在电针预处理诱导脑缺血保护中的作用机制。方法：雄性SD大鼠80只，体重280~320g，随机分为五组（n=16）：假手术组（Sham），对照组(CON)，电针预处理组（EA），HIF-1α抑制剂组（2ME2）和电针预处理+HIF-1α抑制剂组（EA+2ME2）。Sham组动物接受相同的手术操作，但不插入线栓阻闭大脑中动脉；CON组，2ME2组，EA组及EA+2ME2组动物均建立MCAO模型。EA组及EA+2ME2组动物接受连续5d电针刺激，每次30min，最后一次刺激后24h建立MCAO模型；2ME2组及EA+2ME2组动物分别于MCAO模型制备前30min腹腔注射2ME2（16mg/kg）。缺血再灌注后24h，各组动物处死（n=8），TUNEL染色检测神经元凋亡，Western Blot检测缺血半暗带中Bcl2及Bax蛋白表达情况；缺血再灌注后72h，各组动物（n=8）评估神经功能学评分后行MRI检查，而后处死行TTC染色检测脑梗死容积。结果：1.磁共振成像显示：缺血再灌注后72h，Sham组大鼠T1及T2加权图像均无脑梗死区显像，T1加权图像显示脑梗死区效果不佳，EA组T2加权图像中脑水肿程度显著低于CON组（P<0.05）。2.神经功能评分及TTC染色显示：缺血再灌注后72h，与CON组比较，EA组神经功能评分显著改善(P<0.05)，而2ME2可以显著降低EA+2ME2组神经功能评分(P<0.05)。CON组和2ME2组神经功能评分差异无统计学意义(P﹥0.05)。脑梗死容积染色结果与神经功能评分结果一致。3. TUNEL染色显示：缺血再灌注后24h，Sham组脑组织切片中未见TUNEL阳性细胞，而CON组和EA+2ME2组脑组织切片中TUNEL阳性细胞显著多于EA组(P<0.05)，CON组与2ME2组脑组织切片中TUNEL阳性细胞差异无统计学意义(P﹥0.05)。4. Western Blot检测显示：缺血再灌注后24h，与EA组比较，CON组及EA+2ME2组中Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05)；而CON组中Bax蛋白表达显著增加(P<0.05)。CON组与2ME2组中Bcl-2蛋白表达差异无统计学意义(P﹥0.05)。结论：HIF-1α抑制剂2ME2可以拮抗电针预处理诱导的脑缺血保护作用，HIF-1α可能通过抑制缺血后神经元凋亡，上调抗凋亡蛋白Bcl-2表达，下调促凋亡蛋白Bax表达，参与电针预处理诱导的脑缺血保护作用。第三部分研究脑缺血损伤中HIF-1α与Notch信号通路的相互作用关系目的：1.研究脑缺血损伤中HIF-1α与Notch信号通路的活化是否一致。2.探讨HIF-1α在电针预处理脑保护中的活化是否受Notch信号通路调控。方法：雄性SD大鼠32只，体重280~320g，随机分为四组（n=8）：对照组(CON)，电针预处理组（EA），电针预处理+γ分泌酶抑制剂MW167组（EA+MW167）和电针预处理+HIF-1α抑制剂2ME2组（EA+2ME2）。四组动物均建立MCAO模型；EA组，EA+MW167组及EA+2ME2组动物接受连续5d电针刺激，每次30min，最后一次刺激后24h建立MCAO模型；EA+MW167组动物于MCAO模型制备前30min侧脑室注射MW167（1mM，10μL）；EA+2ME2组动物于MCAO模型制备前30min腹腔注射2ME2（16mg/kg）。缺血再灌注后24h，各组动物处死（n=8），免疫荧光双标染色定位观察HIF-1α及NICD在脑内细胞分布情况，Western Blot检测缺血半暗带中HIF-1α及Notch1NICD蛋白表达情况。结果：1.免疫荧光双标染色显示：HIF-1α阳性信号与NICD阳性信号存在共定位。缺血再灌注后24h，EA组缺血半暗带中HIF-1α阳性细胞及NICD阳性细胞均显著多于CON组(P<0.05)，EA组缺血半暗带中HIF-1α/NICD双标阳性细胞数量也显著多于CON组(P<0.05)。2. Western Blot检测显示：缺血再灌注后24h，与CON组比较，EA组缺血半暗带中HIF-1α及NICD蛋白表达显著增加(P<0.05)；γ分泌酶抑制剂MW167阻断Notch通路激活后，EA+MW167组缺血半暗带中HIF-1α及NICD蛋白表达均较EA组显著降低(P<0.05)；而HIF-1α抑制剂2ME2仅降低HIF-1α蛋白表达(P<0.05，EA+2ME2与EA比较)，对NICD蛋白表达无显著影响(P>0.05，EA+2ME2与EA比较)。结论：脑缺血损伤后，HIF-1α与Notch信号通路同时活化；电针预处理可能通过激活Notch信号通路，上调HIF-1α表达，产生脑缺血保护作用。