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流行性乙脑（Japanese encephalitis,JE）又称日本脑炎,是一种由昆虫传播的疾病。该病的致病因子主要是乙脑病毒,这种病毒可以同时感染人和动物。人类感染流行性乙脑病毒会导致直接死亡,存活的人会出现后遗症,这种后遗症是终身存在,不会消失。自从第一例乙脑病例被发现以后,乙脑成为席卷全世界的疾病。主要流行地区在亚洲、大洋洲及非洲,其中东南亚最多。全世界每年约有50000人感染乙脑病毒,其中约15000人死亡。目前,治疗乙脑的特效药还没有研发出来,主要通过免疫接种的方法来减少乙脑感染。乙脑病毒对养猪业影响巨大,会造成养猪业大量的经济损失。乙脑病毒主要的宿主动物是猪。不同猪感染病毒表现不同,母猪感染后表现为生殖性能障碍;公猪感染后出现睾丸炎症状,影响精液质量。在乙脑病毒五种非结构蛋白中,NS1是与病毒基因组复制有关蛋白。本研究计划构建NS1蛋白原核表达质粒,同时表达乙脑结构蛋白M和E,比较三种蛋白免疫效果,为探究JEV非结构蛋白NS1的免疫原性和研制与JEV NS1蛋白相关的疫苗奠定基础。本研究使用原核表达载体pET-28a表达NS1蛋白,并摸索乙脑NS1蛋白体外表达的最佳条件。以Genbank上收录的JEV HW1株表达NS1蛋白的基因序列为模板,设计特异性引物,上游引物插入BamH I限制性酶切位点,下游引物插入Hind III限制性酶切位点。采用融合PCR方法克隆得到NS1核苷酸序列后,利用T4连接酶连接原核表达载体pET-28a和NS1目的片段。经过DNAClub分析,同时将测序结果经过NCBI比对,确定目的基因读码框没有移码或碱基缺失。将构建好的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta（DE3）,加入IPTG 37℃诱导4h。利用SDS-PAGE分析蛋白是否表达,结果显示,NS1蛋白成功表达。同时将原有重组质粒pET-28a-E和pET-28a-M转化大肠杆菌Rosetta（DE3）,IPTG诱导,SDS-PAGE电泳,M蛋白、E蛋白同样表达成功。NS1蛋白、E蛋白、M蛋白相对分子量大小分别为:69kD、63kD、30kD。破碎NS1、M、E三种表达菌液,分析三种蛋白是以哪种表达形式存在,经分析,三种蛋白都是以包涵体的形式表达的。将蛋白包涵体经过变性、复性、纯化等过程,可以获得极少含有杂质的目的蛋白。利用弗式完全佐剂和弗氏不完全佐剂乳化蛋白,免疫BALB/c雌性小鼠,免疫四周后眼眶采血收集血清。血清做1:2-1:256倍比稀释,已知TCID50的乙脑细胞毒作为阳性对照。本试验结果显示,原核表达的NS1蛋白具有免疫原性,与病毒自身释放的蛋白相似。同时NS1蛋白可以介导小鼠产生中和抗体,抗体效价较高。比较三种蛋白免疫效果,NS1蛋白免疫效果最好,抗体水平可以维持较长一段时间。本研究通过原核表达NS1蛋白、M蛋白和E蛋白,为研发NS1相关疫苗奠定了基础,同时为探究NS1的免疫原性做出了贡献。