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目的:
Trim-Away是最近发现的一种在哺乳动物细胞内快速降解特定蛋白的新技术。Trim21是一种E3泛素连接酶,与抗体的Fc段结合后招募泛素-蛋白酶体系统来降解与抗体相结合的蛋白。虽然Trim-Away技术可以在体外培养的细胞中降解目标蛋白,但是该技术在模式动物体内尚未有应用报道。本文旨在将Trim-Away技术运用到模式动物体内,为将来Trim-Away技术的生物学应用及临床应用提供有效的理论基础。
方法:
将TRIM21重组蛋白与靶抗体的混合物直接注射到斑马鱼胚胎的卵黄囊或细胞中。通过westernblotting或实时RT-PCR测定基因表达水平。用t检验评估结果的统计学差异。
结果:
1.Trim-Away技术可以降解EGFP转基因斑马鱼胚胎体内的EGFP蛋白;
2.Trim-Away可以降解在斑马鱼胚胎发育的前几个小时功能活跃的Ddx19B蛋白,斑马鱼胚胎出现眼睛变小、躯干弯曲的表型;
3.Trim-Away可以降解斑马鱼胚胎中母体来源的Dicer1蛋白,斑马鱼胚胎出现严重的发育缺陷,生存期缩短;
4.将TRIM21重组蛋白和靶向抗体共同注射到单细胞期胚胎中可以降解数小时后开始表达的蛋白质,并出现相应的表型,当TRIM21蛋白或抗体消耗完后,目标蛋白开始恢复表达并且能够恢复一部分表型;
5.Trim-Away技术比morpholino敲除技术更快、更早地降解斑马鱼胚胎体内的蛋白;
6.Trim-Away系统在降解中具有特异性:提前注射过表达质粒可以拯救目标蛋白阻止表型缺陷;注射针对基因不同区域的两种不同种属的抗体,均可降解蛋白并产生相似表型;单独注射TRIM21蛋白或与IgG共注射或单独注射抗体并不会影响目标蛋白的变化、不会诱导表型缺陷。
结论:
我们的研究表明Trim-Away技术能够在十几分钟内剔除目标蛋白,因此与基因编辑技术或者靶向mRNA的knockdown技术相比,Trim-Away技术能够更加准确地研究目标基因功能,并且还可能用来清除致病蛋白;与morpholino不同,Trim-Away可以直接降解细胞内任何蛋白,因此可以用来研究母源性蛋白以及一个基因在胚胎发育早期(比如受精后2-3小时)的功能。我们的研究提示Trim-Away技术是一种研究胚胎发育过程中的基因功能的新技术,它可能为人类胚胎发育过程的基因研究提供了新的研究手段;此外,Trim-Away技术还能够用来清除胚胎发育过程中的致病蛋白以及用来防止一些致病蛋白的产生,因此Trim-Away技术还可以防治一些胚胎发育过程中的疾病。
Trim-Away是最近发现的一种在哺乳动物细胞内快速降解特定蛋白的新技术。Trim21是一种E3泛素连接酶,与抗体的Fc段结合后招募泛素-蛋白酶体系统来降解与抗体相结合的蛋白。虽然Trim-Away技术可以在体外培养的细胞中降解目标蛋白,但是该技术在模式动物体内尚未有应用报道。本文旨在将Trim-Away技术运用到模式动物体内,为将来Trim-Away技术的生物学应用及临床应用提供有效的理论基础。
方法:
将TRIM21重组蛋白与靶抗体的混合物直接注射到斑马鱼胚胎的卵黄囊或细胞中。通过westernblotting或实时RT-PCR测定基因表达水平。用t检验评估结果的统计学差异。
结果:
1.Trim-Away技术可以降解EGFP转基因斑马鱼胚胎体内的EGFP蛋白;
2.Trim-Away可以降解在斑马鱼胚胎发育的前几个小时功能活跃的Ddx19B蛋白,斑马鱼胚胎出现眼睛变小、躯干弯曲的表型;
3.Trim-Away可以降解斑马鱼胚胎中母体来源的Dicer1蛋白,斑马鱼胚胎出现严重的发育缺陷,生存期缩短;
4.将TRIM21重组蛋白和靶向抗体共同注射到单细胞期胚胎中可以降解数小时后开始表达的蛋白质,并出现相应的表型,当TRIM21蛋白或抗体消耗完后,目标蛋白开始恢复表达并且能够恢复一部分表型;
5.Trim-Away技术比morpholino敲除技术更快、更早地降解斑马鱼胚胎体内的蛋白;
6.Trim-Away系统在降解中具有特异性:提前注射过表达质粒可以拯救目标蛋白阻止表型缺陷;注射针对基因不同区域的两种不同种属的抗体,均可降解蛋白并产生相似表型;单独注射TRIM21蛋白或与IgG共注射或单独注射抗体并不会影响目标蛋白的变化、不会诱导表型缺陷。
结论:
我们的研究表明Trim-Away技术能够在十几分钟内剔除目标蛋白,因此与基因编辑技术或者靶向mRNA的knockdown技术相比,Trim-Away技术能够更加准确地研究目标基因功能,并且还可能用来清除致病蛋白;与morpholino不同,Trim-Away可以直接降解细胞内任何蛋白,因此可以用来研究母源性蛋白以及一个基因在胚胎发育早期(比如受精后2-3小时)的功能。我们的研究提示Trim-Away技术是一种研究胚胎发育过程中的基因功能的新技术,它可能为人类胚胎发育过程的基因研究提供了新的研究手段;此外,Trim-Away技术还能够用来清除胚胎发育过程中的致病蛋白以及用来防止一些致病蛋白的产生,因此Trim-Away技术还可以防治一些胚胎发育过程中的疾病。