芫花根水提物对肛瘘创面及肛缘肿胀的实验研究

来源 :南京中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:stayrose
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目的:通过芫花根水提物与空白对照及黄芩油膏对比,外用于大鼠肛瘘术后及肛缘水肿换药,观察创面水肿、炎症反应的变化情况及创面的愈合情况。以此验证芫花根治疗痔瘘疾病的有效性与其抗炎、消肿的药理作用相关,并且为芫花根的进一步探索研究提供动物实验研究基础。方法:实验一:在大鼠背上制备肛瘘术后创面模型,将造模成功的大鼠分成A组(生理盐水组)、B组(芫花根组)、C组(黄芩油膏组),分别使用生理盐水、芫花根水提物、黄芩油膏浸泡的纱布给大鼠创面换药。在用药3、7、14天时,取各组的创面组织进行HE染色和MASSON染色,观察肉芽组织变化、炎细胞浸润情况和纤维化变化,并应用PCR定量检测各组大鼠血清中IL-6、IL-12的表达及使用流式细胞术检测各组大鼠外周血中Treg/Th17比例。实验二:建立大鼠肛门巴豆油肿胀模型,造模成功后,将大鼠分成A组(正常组)、B组(生理盐水组)、C组(芫花根组)、D组(黄芩油膏组),A组不做任何处理,B、C、D组每隔4、24、48小时分别将生理盐水、芫花根水提物、黄芩油膏涂于肿胀的肛门处,48.5小时后,取各组大鼠肛周肿胀部位组织进行HE染色和MASSON染色,观察大鼠肛缘肿胀程度、血管生成情况、炎细胞浸润情况和纤维化变化,并行免疫组化检测SM22 α蛋白的表达,免疫荧光染色定位SM22 α蛋白,以及应用PCR和ELISA方法检测各组大鼠血清中IL-17和TNF-α的表达情况。数据均采用SPSS18.0分析。结果:实验一中,PCR定量检测结果显示:用药3天后,A、B、C组IL-12的表达量用X±S表示分别为1.02±0.28、2.52±1.01、2.78±1.83,经统计分析存在显著性差异,P<0.05(P=0.011),而B、C组对比,统计学上无明显差异,P>0.05(P=0.648)。三组中IL-6表达量用 X±S 表示分别为 1.04±0.46、0.84±0.29、0.69±0.33,P>0.05(P=0.157),无统计学差异。用药7天后,三组IL-12的表达量分别为0.80±0.24、2.75± 1.13、3.02±2.21,经统计分析存在显著性差,P<0.05(P=0.006),而B、C组对比,无明显差异,P>0.05(P=0.700)。三组中IL-6表达量分别为1.86±0.56、0.62±0.21、0.53±0.23,经统计分析存在显著性差异,P>0.05,而B、C组对比,则无明显差异。P>0.05(P=0.589)。用药14天后,三组IL-12的表达量分别为0.49±0.21、3.48±1.45、4.19±1.48,经统计分析存在显著性差异,P<0.05,而B、C组对比,则无明显差异,P>0.05(P=0.237)。三组中IL-6表达量分别为2.84±0.99、0.49±0.23、0.31±0.14,经统计分析存在显著性差异,P>0.05,而B、C组对比,则无明显差异P>0.05(P=0.516)。HE染色显示:用药3天后A、B、C三组均有纤维脂肪组织中见大量急慢性炎细胞浸润,局部肌肉组织变性坏死,血管增生,管壁增厚,A组中还见间质水肿和血管闭塞,说明A组炎症表现更重,B、C较A组稍轻,两组炎症程度相当。用药7天后三组纤维脂肪组织中仍有大量急慢性炎细胞浸润,A、C组局部肌肉组织变性坏死、钙化,B、C组局部有肉芽组织形成,说明B、C组创面开始修复。用药14天后B、C组组织中炎细胞浸润较A组明显减少,且有玻璃样改变,说明创面开始有瘢痕组织形成。Masson染色显示:用药3天后创面组织中见大量粘液及有胶原纤维生成,并且B、C组中多于A组。用药7天后创面组织中胶原纤维增多,且B、C组比A组多。用药14天后A组创面组织中胶原纤维增减少B、C组中胶原纤维增多。流式细胞术检测外周血Treg/Th17比例的结果用X±S表示为:用药3天后,A、B、C组分别是0.663±0.042、0.770±0.009、0.926±0.002,经统计分析存在显著性差异,P<0.05(P=0.004)。用药7天后,分别是0.565±0.001、1.077±0.033、1.372±0.065,经统计分析存在显著性差异,P<0.05(P=0.001)。用药14天后,分别是0.295±0.011、1.722 ±0.074、2.362±0.187,经统计分析存在显著性差异,P<0.05(P=0.001)。实验二中,PCR定量检测TNF-α及IL-17指标的结果显示:A、B、C、D四组中TNF-α 的表达量以 X±S 表示分别为 0.88±0.21、5.03±1.31、2.63±0.96、1.57±0.27,P<0.05,存在显著差异,而C、D组对比,统计学上无明显差异,P>0.05(P=0.073)。四组中IL-17表达量为0.92±0.26、3.37±0.85、2.15±0.45、1.48±0.39,经统计分析存在显著性差异,P<0.05,而C、D组对比,统计学上无明显差异,P>0.05(P=0.072)。ELISA定量检测TNF-α及IL-17指标的结果与PCR检测结果相符,P值均小于0.05,存在显著性差异。HE染色示:A组见正常的肛周粘膜、肌肉等组织。B、C、D组的肛周粘膜、肌肉组织中均见急慢性炎细胞浸润,C、D组较A组少,C组较D炎细胞浸润更少,且C组中未见肌肉组织坏死,并伴有小血管增生,说明C、D组用药后较A组炎症性水肿消退,且C组炎症、水肿程度最轻。MASSON染色观察肛缘纤维化程度的结果为:A组中见正常肛缘组织,B组见大量粘液及胶原纤维生成,C组和D组经药物治疗后见少量粘液及胶原纤维生成。免疫组化检测SM22α蛋白的表达用IOD值表示结果,A、B、C、D分别为8841.39±49841.88、4339.75±24700.33、7211.28±29230.33、7702.81±39702.19,四组经统计学分析,有显著性差异,P<0.05,但是C、D两组比较,统计学上无明显差异,P>0.05(P=0.166)。免疫荧光染色显示:SM22α蛋白及STIM1蛋白位于细胞质内,红色荧光位于细胞核中,所以Orail蛋白位于细胞质中。结论:芫花根水提物具有减轻痔瘘术后炎症反应、术后水肿的作用。在创面愈合的早中期减少炎细胞渗出,增加胶原纤维产生,提高SM22 α蛋白的表达,进而促进痔瘘术后创面的愈合。
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