论文部分内容阅读
解旋酶是一类以ATP依赖的方式来催化破坏DNA或RNA之间的氢键的分子马达蛋白,参与细胞内多种代谢过程。Pif1解旋酶是广泛存在于病毒、原核和真核生物中的5’-3’方向解旋的SF1B解旋酶成员,近年来关于Pif1解旋酶的研究成果逐渐增多,得到了很多结构方面的数据,为理解Pif1解旋酶的工作机理和生物学功能提供了很多依据。2016年本实验室Chen et al.发表来自物种Bacteroides spp的Pif1解旋酶的BsPif1-AMPPNP,BsPif1-ADP,BsPif1-ADP-AlF3-ssDNA复合体三级晶体结构,建立了BsPif1-dsDNA复合体结构模型并提出BsPif1解旋dsDNA的工作机理。但是BsPif1作为一种特异性的G-四链体DNA（G4 DNA）解旋酶,它是如何解开G4 DNA,解旋G4 DNA的区域在何处,与G4 DNA相互作用的特异性位点有哪些,这些信息都是未知的。故我们对BsPif1继续进行深入研究,期望能够得到BsPif1与G4 DNA的复合体结构,深入研究BsPif1与G4 DNA之间的相互作用,找到BsPif1与G4 DNA相互作用的特异性位点,为理解Pif1解旋酶在细胞内发挥的生物学功能提供更多的数据支撑。首先通过原核表达及纯化得到纯度达到95%的BsPif1解旋酶,通过体外退火、Mono-Q离子交换层析方法纯化得到纯度较高且性质稳定的核酸底物,进而采用凝胶过滤层析、动态激光散射等方法,筛选到能够与BsPif1形成稳定的复合体的核酸底物,进行复合体结晶初筛实验。分别选择了5’端带尾链长度>6nt的两种G4 DNA（7T 3G4、6T TelG4）及一种dsDNA（7T11bp）尝试了复合体结晶筛选。在分别尝试了1152种结晶条件以后,目前还没有得到一个复合体晶体。因此本课题通过分子动力学模拟建立了BsPif1-G4 DNA复合体的三维结构,利用点突变实验分析BsPif1作用于G4 DNA的特异性位点。此外,荧光各向异性（FA）、快速停留荧光共振能量转移（stopped-flow FRET）、单分子荧光共振能量转移（smFRET）等3种方法分析BsPif1作用于G4 DNA的特异性氨基酸位点。最终得出以下结论:1.荧光各项异性分析位点突变对DNA结合活性的影响。结果表明,K92、R120、K121、K292、K341这5个位点对混合构型的TelG4 DNA的结合起到非常重要的作用,而R83、K87、K92、R120、K121、K292、K341这7个位点均对平行构型的3G4DNA以及dsDNA的结合起到非常重要的作用。2.快速停留荧光共振能量转移技术测定BsPif1突变体蛋白对G4 DNA和dsDNA的解旋活性,从解旋速率和解旋幅度这两个参数来分析位点突变的影响。结果表明,位于1B结构域的R83位点是特异性解旋G4 DNA的重要位点,其对dsDNA的解旋没有直接作用;而位于2B结构域的K341位点是特异性解旋dsDNA的重要位点,其对G4 DNA的解旋没有直接作用;K92、R120、K121、K292这4个位点是同时参与解旋G4 DNA和dsDNA的重要位点,其中R120的突变对G4 DNA的解旋产生较大影响。3.单分子荧光共振能量转移技术进一步分析BsPif1位点突变对解旋G4 DNA的活性的影响,结果表明R83、K92、R120、K121、K292这5个位点参与G4 DNA的解旋,与stopped-flow FRET分析得出的结论一致。最终发现位于1B结构域的R83是特异性地参与G4 DNA解旋的位点,其对dsDNA的解旋没有影响,并且位于1A结构域的R120位点对G4 DNA的解旋有重要作用。同时点突变实验结果也证明运用分子动力学手段建立的BsPif1-G4 DNA复合体结构模型对理解BsPif1与G4 DNA相互作用提供了重要的参考价值,这将会对后续指导我们研究BsPif1解旋酶的机理有很大的价值。