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目的:口腔颌面部癌症的发病率约占全身恶性肿瘤发病率的5-10%,因为口腔颌面部特殊的解剖位置,目前口腔癌患者的五年生存率仅为50%左右,它严重威胁着人类的生命和健康。在这其中,约有90%的口腔癌为上皮源性,即口腔鳞状细胞癌（oral squamous carcinoma cell,OSCC）。舌体是口腔颌面部鳞状细胞癌发病率最高的部位,约占口腔癌40%以上。舌癌[1]发病率在男性约为0.50.6/10万,女性约为0.40.5/10万,近年来,随着生活环境的变化,人类舌癌的发病率没有减少,反呈明显逐年上升的趋势,同发病年龄也日趋低龄。目前舌癌的治疗仍是以手术为首选,并辅以局部放疗和全身化疗的综合治疗,但手术造成的功能障碍和外貌畸形对患者来说是不愿承受的,而放化疗对患者机体也存在着严重的毒副作用,因而寻一种找积极有效并且毒副反应低的治疗药物成为一项十分迫切的重要任务。束骨姜黄醇（xanthorrhizol）最早是由German Rimpler于1970年自束骨姜黄（Curcuma xanthorrhiza）中所分离出来的一种倍半萜类化合物（sesquiterpene compound）。束骨姜黄醇已证明具有多种的生物活性,如抗菌和抗真菌活性,抗炎抗氧化作用等。其抗肿瘤作用亦是近年来研究热点之一,现研究已证明束骨姜黄醇能对包括乳腺癌,结肠癌在内的多种癌细胞产生较强的抑制作用,同时能抑制多种肿瘤相关蛋白的表达。COX-2及iNOS是目前研究较多的两种基因蛋白分子,两者在恶性肿瘤的发生发展具有关键性的促进作用[2],目前研究[3-5]发现,COX-2、iNOS在包括舌癌、乳腺癌、子宫内膜癌细胞中表达呈显著正相关,而其联合表达与肿瘤的生物学行为密切相关,可能共同影响肿瘤的血管生成,参与肿瘤的浸润和转移。两者之间存在着较为密切的关系,能够被生长因子、紫外线、细胞因子、某些化学药物等激活,其作用位点是目前治疗恶性肿瘤的重要靶点之一[6-8]。本实验研究用一定浓度的束骨姜黄醇干预Tca8113细胞,观察其对Tca8113细胞的生长抑制作用及相应COX-2、iNOS蛋白表达变化情况,同时对束骨姜黄醇联合氟尿嘧啶（5-Fu）对Tca8113细胞的影响作用进行了初步的探索,为临床研究提供新思路和实验依据。方法:将复苏后的舌癌Tca8113细胞置于37℃,5%CO2饱和湿度的常规条件下培养,待细胞进入对数生长期后用于实验。1束骨姜黄醇对Tca8113细胞生长抑制及蛋白表达测定1.1 MTT法检测细胞生长与增殖抑制:按实验分组,实验组中,加入不同剂量的束骨姜黄醇溶液,使其终浓度为10μmol /L、20μmol /L、40μmol /L、80μmol /L,设空白调零组,不接种细胞,设空白对照组,只加等量培养基培养细胞,继续将培养板移入恒温培养箱中原条件下培养72h,分别在24h、48h、72h检测每孔细胞的OD值,计算细胞生长抑制率。1.2流式细胞术（FCM）检测COX-2、iNOS基因蛋白的表达情况:收集经不同浓度束骨姜黄醇（20μmol /L、40μmol /L、60μmol /L）作用0h、12h、24h、48h、72h的舌癌Tca8113细胞及对照组细胞,按常规方法进行荧光标记,流式细胞仪检测荧光强度,以平均荧光强度道数表示蛋白的表达量。2束骨姜黄醇联合氟尿嘧啶对Tca8113细胞的抑制作用（具体方法同1.1）2.1取不同时间点及不同剂量的氟尿嘧啶单药溶液干预Tca8113细胞,其终浓度为5μmol /L、10μmol /L、20μmol /L、40μmol /L,测得其24h、48h、72h内抑制率。2.2在原束骨姜黄醇单一用药基础上加入10μmol/L氟尿嘧啶,检测每孔细胞的OD值,计算细胞生长抑制率,并测得两药联合应用的相互作用指数。2.3在原氟尿嘧啶单一用药基础上加入20μmol/L束骨姜黄醇,检测每孔细胞的OD值,计算细胞生长抑制率,并测得两药联合应用的相互作用指数。结果:1束骨姜黄醇对Tca8113细胞生长抑制及相关蛋白表达影响1.1束骨姜黄醇对Tca8113细胞生长、增殖的影响1.1.1 OD值:不同浓度的束骨姜黄醇干预Tca8113细胞后,除24h同48h组无显著性差异外（P=0.09>0.05）,其余各浓度时间组均有显著性差异（P<0.01）,实验结果表明束骨姜黄醇对Tca8113细胞OD值的影响在时间与浓度之间有交互作用。生长曲线显示:作用时间相同,束骨姜黄醇浓度越高,生长曲线越低;药物浓度相同,随着作用时间增加,生长曲线相对平缓,浓度和时间有交互性,药物浓度越大,作用时间越长,生长曲线压低越明显。1.1.2抑制率:随着束骨姜黄醇浓度的增加,细胞生长抑制率逐渐增高,作用时间相同,10μmol /L、20μmol /L、40μmol /L、80μmol /L束骨姜黄醇抑制率的平均数分别为11.04%、17.84%、26.92%、40.45%,随浓度增加,抑制率显著增加,作用浓度相同,24h、48h、72h抑制率的平均数分别为14.57%、25.47%、32.14%,随时间增加,抑制率增加,各浓度组间比较,存在显著统计学差异（P<0.01）;各干预时间组间比较,存在显著统计学差异（p<0.01）。24h、48h、72h IC50值分别为85.11μmol /L、60.26μmol /L、48.99μmol /L,随浓度增加IC50显著降低。实验结果表明浓度越高,干预时间越长,抑制率越大,呈显著浓度-时间依赖性关系。1.2 FCM检测束骨姜黄醇作用于舌癌Tca8113细胞后COX-2、iNOS蛋白的表达。1.2.1 COX-2蛋白平均荧光强度:在时间因素方面,各组蛋白表达差异均具有显著性（P<0.01）;这提示着束骨姜黄醇随着其对Tca8113影响时间的增加,COX-2蛋白表达持续降低;在浓度因素方面,随着束骨姜黄醇用药浓度的增加,COX-2蛋白表达持续降低,各组间比较均有显著性差异（P<0.01）,提示浓度梯度对COX-2蛋白的表达具有较强相关性。根据线性关系随着束骨姜黄醇药物浓度、作用时间的增加,COX-2蛋白的表达逐渐降低。1.2.2 iNOS蛋白平均荧光强度:在时间因素方面,48h组与72h组相比,无显著性差异（P=0.076>0.05）,除此之外,束骨姜黄醇随着其对Tca8113影响时间的增加,iNOS蛋白表达降低。在浓度因素方面,随着束骨姜黄醇用药浓度的增加,iNOS蛋白表达持续降低,各组间比较均有显著性差异（P<0.01）,提示浓度梯度对iNOS蛋白的表达具有较强相关性。根据线性关系随着束骨姜黄醇药物浓度、作用时间的增加,iNOS蛋白的表达逐渐降低。生长抑制实验及COX-2、iNOS结果均表明束骨姜黄醇对Tca8113细胞有明显的的抑制作用。2束骨姜黄醇联合氟尿嘧啶对Tca8113细胞生长、增殖的影响2.1不同剂量的5-Fu作用24h、48h、72h对Tca8113细胞的抑制作用随时间及浓度的增长而增加,说明5-Fu单独作用于Tca8113细胞的抑制率随药物浓度的增长及处理时间的延长而增强,即5-Fu对Tca8113细胞的抑制效应呈剂量和时间依赖性关系。2.2在应用10μmol /L氟尿嘧啶后,束骨姜黄醇在24h、48h、72h时IC50值由单一用药时85.11μmol /L、60.26μmol /L、48.99μmol /L,下降到46.22μmol /L、33.4μmol /L、26.71μmol /L,氟尿嘧啶与各个浓度的束骨姜黄醇联用时,皆为为协同相加及增强关系,在中低浓度尤其明显。2.3在应用20μmol /L束骨姜黄醇后,氟尿嘧啶在24h、48h、72h中IC50由单一用氟尿嘧啶时39.04μmol /L、32.23μmol /L、28.68μmol /L,下降到24.94μmol /L、17.06μmol /L、13.55μmol /L,束骨姜黄醇与20μmol /L的氟尿嘧啶合用时,皆为为协同相加及增强关系,抗增殖的作用均明显加强,在中低浓度尤其明显。结论:1束骨姜黄醇能明显的抑制舌癌细胞Tca8113细胞的生长及增殖,其抑制效应同束骨姜黄醇的浓度梯度及作用时间有较为密切的关系。2束骨姜黄醇能较为明显的抑制舌癌细胞Tca8113细胞COX-2及iNOS蛋白表达,其对两种蛋白抑制效应同束骨姜黄醇的浓度梯度及作用时间皆有较为密切的关系。3 Tca8113中COX-2及iNOS蛋白表达在束骨姜黄醇干扰时具有其相应联动效应,提示其二者之间存在相应对话机制。4束骨姜黄醇同氟尿嘧啶联用能显著增强其对Tca8113细胞的抑制效果,两药在中低浓度具有较强的协同效应。