AMP激活的蛋白激酶(AMPK)的过表达在肝星状细胞株LX2中的作用及信号转导机制

来源 :南方医科大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:fg1978
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肝纤维化是各种慢性肝病所共有的病理学的变化,也是向肝硬化甚至肝癌发展的中心环节。而肝星状细胞是肝脏中形成纤维的主要细胞类型。当肝脏受到损伤时,肝星状细胞在各种因素的刺激下被激活成肌成纤维样细胞(myofibroblast like cell,MFBLC),大量的增殖,表达、分泌和重塑胶原及非胶原的基质蛋白,以及致纤维化和致炎的细胞因子和化学因子,和金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP),导致纤维在肝脏中积累形成肝纤维化。而在肝纤维化的消退过程中伴随着激活的肝星状细胞的凋亡,这样一是减少了基质蛋白的来源,同时对基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)的抑制剂也减少了。所以诱导肝星状细胞的凋亡成为了治疗肝纤维化的潜在策略。因为肝纤维化是各种肝脏疾病的前期病变,如果能在此阶段对病情进行治疗或抑制,将大大降低肝病恶化的可能性。 近年的研究证实 AMP 激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)的过表达可以诱导大鼠肝细胞、成神经瘤细胞以及MIN细胞的凋亡,但整个凋亡的信号通路还不是很清楚。AMPK是细胞内能量状态的感受器,当细胞内AMP和ATP的比值升高到一定程度时,AMPK就会被激活。AMPK可以抑制短期内不影响细胞存活的消耗ATP的合成代谢通路,而激活生成ATP的分解代谢通路。但当AMPK在细胞中过表达时,它可以激活c-Jun氨基末端蛋白激活(JNK)的活性,通过转录因子c-Jun的作用调节蛋白的表达,并通过caspase家族的作用最终导致细胞凋亡。AMPK是由α、β、γ三个亚基组成的蛋白激酶,其中α亚基是催化亚基,β、γ是调节亚基。5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(5-amino-4-imidazolecarboxamide-riboside,AICAR)是研究中应用较多的AMPK激活剂。AICAR是腺苷的类似物,它在细胞里转换为环腺苷-磷酸衍生物5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-D-ribofuranosyl-5-monophate(ZMP)。ZMP是AMP的类似物,具有激活AMPK的作用。但值得注意的是,AICAR是介导嘌呤生物合成的物质,同ZMP、ZDP和ZTP一样它还有其它细胞效应,并非AMPK的特异激活剂。随着对AMPK研究的深入,研究者已经发现截短的AMPKα亚基1-312氨基酸的肽段不再与β和γ亚基结合,但是保留了大部分的酶活性,并且此截短的肽段172的苏氨酸突变成天冬氨酸后,可以阻止蛋白磷酸酶对它的去磷酸化失活作用,从而具有了组成性的激酶的活性。有研究者已经构建了可以在真核细胞中表达此肽段的重组腺病毒,为进一步研究AMPK的作用提供了很好的工具。 本实验用表达组成性激活的AMPK的腺病毒(Ad-AMPK)感染肝星状细胞株LX2,证实了重组腺病毒可以高效的介导AMPK在LX2细胞中的过表达,并且最终诱导了细胞的凋亡。对凋亡信号通路的进一步研究发现,Bcl-2在LX2中是低表达的,而Bax在AMPK过表达之后,表达增加,而用RNAi方法敲低Bax之后,细胞再用携带AMPK基因的腺病毒感染,LX2细胞不再发生凋亡,说明Bax参与了AMPK诱导LX2凋亡的信号通路。 本实验的主要结果和结论如下: 1.用重组腺病毒介导组成性的AMPK在LX2细胞中过表达。以腺病毒滴度pfu为100感染LX2细胞,在不同的时间(24、48、72h)收获细胞,用免疫印记的方法检测外源AMPK的表达,发现在48h之前外源AMPK的表达检测不到,而在72h表达明显增加。说明AMPK的表达在48h到72h之间,并且其活性至少可以持续到72h。后续的试验中在72h收获细胞。2.LX2细胞感染Ad-AMPK后,用PI单染流式细胞仪检测到有凋亡特征性的亚二倍体峰出现,提示LX2细胞发生了凋亡;并且细胞DNA出现凋亡特征性的梯状条带,进一步说明细胞发生了凋亡。 3.LX2细胞感染Ad-AMPK后,免疫印记检测到Bax表达上调,pro-cascpasc-3减少,说明casepase-3前体被激活形成了活性的凋亡执行蛋白casepase-3,而Bcl.2在LX2细胞中是低表达的,说明AMPK介导的LX2细胞的凋亡是和线粒体上Bcl-2家族是有密切关系的。 4.用RNAi的方法将Bax敲低之后,再用Ad-AMPK感染LX2细胞,细胞不再容易成团,并从培养瓶底脱落,发生凋亡,而是长势良好。 5.用RNAi的方法将Bax敲低之后,再用Ad-AMPK感染LX2细胞,pro-casepase-3与对照组差异变得很小,RNAi Bax抑制了AMPK诱导LX2细胞凋亡的作用。同时说明Bax是AMPK诱导LX2细胞凋亡通路上的重要分子。 总之,本实验以诱导肝星状细胞凋亡可以缓解肝纤维化为导向,证实AMPK的过表达可以诱导肝星状细胞株LX2的凋亡,希望对肝纤维化的临床治疗有一定的借鉴意义。同时对AMPK诱导LX2凋亡的信号通路进行了进一步的研究,为AMPK诱导细胞凋亡的信号通路增加了一个新成员——Bax。
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