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论文的第一部分研究了巴西固氮螺菌Yu62在玉米根部的定殖。将pGFPmut2质粒中的gfp基因（编码绿色荧光蛋白）克隆到载体pVK100（可在巴西固氮螺菌中复制）上,构建成重组质粒pVK1001。将pVK1001通过电转化方法导入到巴西固氮螺菌Yu62中,经检测带有gfp基因的质粒在该菌中能稳定表达,这样就获得了GFP标记的巴西固氮螺菌Yu62菌株。用标记菌株接种限菌培养条件下生长的玉米（农大3318）幼苗,在接种8天、12天后,取其根部,用激光共聚焦扫描显微镜进行观测。结果表明巴西固氮螺菌Yu62菌株可侵入到玉米根部皮层的薄壁细胞间隙。用扫描电镜和超薄切片电镜观察,可得到相同的结论,大多数细菌主要定殖于根表,少数菌可进入玉米根组织内。 论文的第二部分是关于两株固氮芽孢杆菌的分离和鉴定。首先采集土壤样品,来自中国农业大学科学园区不同作物的根际,以及药用植物园内多种木本和草本植物根际。用严格的筛选确定有固氮能力的芽孢杆菌,初筛程序包括:土壤悬液经80℃水浴消煮,取稀释液涂无氮平板,分离、纯化无氮平板上的单菌落,获得15株菌落形态上有所区别的菌株。继而以这15株总DNA为模板,扩增固氮酶结构基因nifH片段;用液体法检测固氮酶活,酶活仅在有氧时从部分菌株中可测得,厌氧时所有菌株均测不到酶活;以一株芽孢杆菌中扩增的部分nifH标记为探针,同15株菌株酶切的总DNA进行Southern杂交。综合PCR扩增结果、酶活检测结果和杂交的阳性信号,证明其中两菌株为可固氮的芽孢杆菌,经16S rDNA测序初步鉴定为Bacillus megaterium C4和Paenibacilluspolymyxa N4。其中菌株C4的性状较好,构建了C4基因组的λ噬菌体文库。 论文的第三部分是关于从固氮芽孢杆菌中克隆glnB基因。用自行设计合成的简并引物,从B.megaterium C4和Paenibacillus polymyxa G2（本实验室分离的固氮菌）中进行PCR扩增得到glnB的部分序列。同源性分析表明,B.megaterium C4中的glnB基因的编码产物即PⅡ蛋白与Rhodospirillum、Magnetospirillum及Azospirillum属各菌株的PⅡ蛋白同源性较高;P.polymyxa G2中的glnB基因的编码产物即PⅡ蛋白与Pseudomonas、Xanthomonas、Burkholderia及Azoarcus菌属各菌株的GlnB/GlnK蛋白有较高同源性,但与枯草芽孢杆菌中的PⅡ同源蛋白即NrgB序列相比同源性均较低,小于50%。为了通过突变体DNA酶切、自连的方法获得glnB的全基因序列,构建了多种整合载体,带有可在阳性菌中表达的多种抗生素抗性标记。将带有温度敏感型复制子的阳性菌质粒pE194,改造为芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭载体,转化芽孢杆菌宿主后可通过控制温度使其同样起到整合载体的作用。多次用不同方法转化菌株C4,但均没有成功。就菌株G2的电转化条件,从washing buffer、菌体生长的OD600值、向buffer中添加各种细胞壁形成的干扰物质、在复育培养基中加入高渗剂,以及电场强度等多方面进行了优化,最终可使转化率达到103-104转化子/μgDNA,且该结果具有可重复性。在此基础上用构建的整合载体转化G2菌株,但没有筛选到正确的单交换突变体。同时,已转化有pE194温度敏感复制子构建质粒的G2菌株,在43-48℃温度范围内培养,不能得到同源单交换的突变体,但可得到理论上以很低机率发生的不依赖于同源片段的异常重组。因此,推测在Paenibacillus polymyxa G2中小于300bp的片段可能不足以导致同源重纪。