论文部分内容阅读
目的:脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)一种严重的脑血管病,占脑卒中发病率的15%左右,有极高的致死率和致残率,造成了严重的社会负担。脑出血后病灶周围神经细胞的变性、坏死或凋亡是造成脑出血后患者神经功能障碍的主要原因。已有研究显示,ICH后血肿形成对周围脑组织的压迫和破坏可导致原发性脑损伤,而ICH后的游离的红细胞及其代谢产物,坏死的神经细胞和细胞因子等可引发炎症反应,影响凝血及纤溶系统,进一步加剧血肿周围脑水肿的形成,导致更严重和持久的继发性损伤。目前,ICH患者的治疗手段有限,预后不良。因此,能够针对性改善ICH后血肿灶周组织缺血缺氧、水肿、神经细胞凋亡等的治疗研究颇为重要。近年来,骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BM-MSCs)来源于中胚层,在骨髓中含量丰富,也存在于结缔组织和器官间质中。作为成体干细胞中的一种,BM-MSCs具有自我更新能力和多重分化潜能,被认为可能在促进ICH大鼠神经功能恢复中发挥重要作用。以往认为BM-MSCs首先迁移到组织受损部位,通过分化成神经元或神经胶质细胞发挥神经修复的作用。但是,越来越多的研究者发现BM-MSCs在体内的存活和分化能力有限,更有可能通过旁分泌的方式释放多种包裹核酸、蛋白质等物质的囊泡和具有神经保护活性的细胞因子,通过促进血管生成、减少神经元凋亡从而发挥神经保护作用。我们在前期研究中发现,microRNA-21(miR-21)在ICH患者外周血及血肿周围脑组织中的表达水平显著下降。大量研究结果显示miR-21在脊髓损伤、肿瘤等疾病的凋亡、自噬等过程中发挥着重要作用,但其在BM-MSCs对ICH疾病治疗中的作用尚不明确,还需进一步探究。本研究拟通过稳定转染rno-miR-21至BM-MSCs,注射到ICH大鼠动物模型脑中,观察过表达miR-21的BM-MSCs对ICH大鼠神经功能恢复的作用,其存活能力的变化和ICH后血肿灶周神经细胞抗凋亡能力的变化,可能为今后BM-MSCs治疗ICH提供新的理论依据。研究方法:本研究采用立体定位脑内注射胶原酶VII法将体重250~300克的Wistar大鼠制成ICH动物模型。将慢病毒稳定转染miR-21的BM-MSCs通过脑立体定位的方法注射到病灶区域。实验分为假手术组(Sham组)、对照组、MSC组、MSC-NC组及MSC-miR-21组。测量脑组织的水含量,判断脑组织的水肿程度;通过转角试验(corner test)和前肢放置实验(forelimb placement test)对ICH大鼠进行神经功能评分;采用苏木精—伊红染色法(hematoxylin-eosin staining)对每组大鼠脑切片进行染色,并测量和分析脑中的血肿面积;通过PKH26活细胞膜染料对各组BM-MSCs进行染色,在体内示踪BM-MSCs并计算其存活率;使用蛋白免疫印记法(Western Blotting)检测基质金属蛋白酶2(Matrix Metalloproteinase 2,MMP2),基质金属蛋白酶9(Matrix Metalloproteinase 9,MMP9)、和基质金属蛋白酶抑制剂1(Tissue Inhibitor Of Metalloproteinases 1,TIMP1)表达水平变化判断脑组织损伤程度。氯高铁血红素(Hemin)用于模拟体外ICH环境,将BM-MSCs与PC12细胞进行共培养。通过流式细胞分析、转移酶介导的三磷酸脱氧鸟苷-生物素刻痕末端标记法(TUNEL法)和Western blotting检测cleaved Caspase-3的方法观察细胞凋亡情况。使用外泌体(exosomes)提取试剂盒提取外泌体后通过Western印记的方法检测CD9、CD63及CD81等外泌体标记蛋白,以验证提取所得为外泌体。使用PKH26对BM-MSCs来源的exosomes进行标记,与PC12在体外共培养后观察exosomes与类神经元的融合情况。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测各组exosomes、体外共培养的PC12细胞中及体外各组大鼠脑组织中miR-21的表达水平。通过靶基因预测网站在线预测miR-21潜在的靶基因,使用qRT-PCR对候选靶基因进行筛选,并通过双荧光素酶报告基因系统(Dual-Luciferase Reporter Assay)验证miR-21与瞬时受体电位M型7基因(Transient Receptor Potential Melastatin 7,TRPM7)的mRNA可以直接结合。最后,通过干扰TRPM7的表达发现miR-21可能通过调控TRPM7继而调控NF-κB通路实现对ICH后血肿灶周神经元的保护作用。结果:1、miR-21过表达的BM-MSCs可以明显降低ICH大鼠的脑水肿程度(P<0.05)。2、miR-21过表达的BM-MSCs可以有效改善ICH大鼠的神经功能评分(p<0.05)。BM-MSCs对ICH大鼠神经功能缺损有改善作用,但不具有统计学意义(p>0.05)miR-21过表达的BM-MSCs相比BM-MSCs-NC效果更为明显(p<0.05)。3、miR-21过表达的BM-MSCs可以显著减小ICH大鼠的血肿面积和脑组织损伤。4、miR-21可以有效增加BM-MSCs在ICH大鼠脑中的存活率。(P<0.05)5、miR-21过表达的BM-MSCs可以减少ICH后血肿灶周神经元的凋亡,对星型胶质细胞的作用不明显。6、miR-21可以提高体外Hemin处理条件下BM-MSCs的抗凋亡能力,但增殖能力无明显变化。7、miR-21过表达的BM-MSCs来源的外泌体可以与PC12细胞在体外进行膜融合,抑制外泌体分泌后,与之共培养的类神经元的抗凋亡能力显著下降,ICH大鼠神经功能恢复程度减弱。8、miR-21过表达的BM-MSCs可以降低PC12细胞中TRPM7的表达水平,并通过抑制NF-κB通路抑制ICH体外条件下PC12细胞的凋亡。结论:1、miR-21可以有效提高BM-MSCs对ICH大鼠的神经功能恢复的作用。2、miR-21可以显著提高BM-MSCs在ICH大鼠脑内的存活率及体外氯高铁血红素处理条件下的抗凋亡能力。3、BM-MSCs可以通过外泌体将miR-21传递至神经元,在神经元中通过与TRPM7 mRNA的3’-UTR区直接结合降低TRPM7的表达水平,进一步抑制NF-κB途径的活化从而实现神经保护作用。miR-21过表达的BM-MSCs通过释放富含miR-21的外泌体,上调神经元内miR-21的含量并通过miR-21/TRPM7/NF-κB途径显著增强神经元的抗凋亡能力,miR-21可增强BM-MSCs对ICH大鼠神经功能恢复的作用,可能为ICH的治疗提供新的策略。