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研究目的探索血液系统肿瘤细胞系中生物钟基因Bmal1及Per2在转录水平上的表达情况，明确体外培养条件下的血液系统肿瘤细胞系中是否存在生物钟基因转录水平上的昼夜波动，并对其转录水平变化进行以时间为变量的余弦函数拟合，以预测体外培养条件下生物钟基因转录的高峰和低谷时段，为进一步研究血液系统肿瘤发生、发展与钟基因的关系提供理论基础。研究对象和方法1研究对象1）人伯基特淋巴瘤Raji细胞系；2）人皮肤T细胞淋巴瘤Hut-78细胞系；3）弥漫大B细胞淋巴瘤OCI-LY8细胞系；4）髓系白血病HL-60细胞系。2方法2.1细胞培养四种细胞系分别接种于含10%胎牛血清的RIPA1640培养基，并在C02、37℃培养箱中常规培养，间隔2-3天换液。2.2生物钟基因节律表达的同步诱导细胞生长稳定时(对数期内)更换含0.5%胎牛血清的RIPA1640培养基进行饥饿培养2天，饥饿培养后更换培养基为50%胎牛血清的PIRA1640培养基培养进行血清休克诱导同步节律的产生，并将此时刻时间记为ZT0，2小时后更换无血清培养基。按照时间顺序，将ZT0时刻后4小时计为ZT4，8小时后计为ZT8，以此类推。2.3测定mRNA含量在ZT（0、4、8、12、16、20、24）时刻分别使用Trizol提取不同细胞系的总RNA，检测RNA纯度和完整性；使用逆转录试剂盒合成cDNA；应用Real-timePCR定量测定Per2、Bmal1mRNA的表达。2.4统计学分析将目的基因的Ct值与内参基因Ct值的差值△Ct作为基因的相对表达水平。对同种细胞同种基因在不同时间点的△Ct值进行正态性及方差齐性检验，对符合条件的数据进行单因素方差分析，数据采用Mean±SD表示，P<0.05为差异具有显著性。通过方差分析判定差异有显著性的基因则进行余弦节律拟合。应用余弦分析软件和CronoLab软件获取节律性参数，用于拟合的余弦函数方程为F（t）=M+Acos(ωt+φ)其中M为中值；A为节律震荡的振幅；φ为峰值相位，是震荡达到峰值的时刻所换算出的角度，根据ω角度（360°/24h）可将其换算成ZT时点结果1.血清休克法节律诱导的Raji细胞中生物钟基因Bmal1在一天内不同时间点的表达差异无统计学意义（P>0.05），认为无法通过血清休克法诱导Raji细胞内Bmal1基因的节律性表达；血清休克法可诱导的OCI-LY8、Hut-78、HL-60细胞中生物钟基因Bmal1与Per2及Raji细胞中生物钟基因Per2在一天内不同时间点mRNA转录水平存在昼夜节律性，且这种细胞内生物钟基因表达的节律性可用余弦函数来进行的大致描述；2.应用余弦分析软件及CronoLab软件进行余弦方程拟合，将同种细胞同种基因转录mRNA的量在一天内的相对变化情况拟合为以时间t（小时）为变量的余弦函数，可得余弦方程为：OCI-LY8细胞转录Bmal1可拟合为F（t）=13.9+5.4cos（15t），转录Per2可拟合为F（t）=9.6+4.1cos（22.5t+90）；Hut-78细胞转录Bmal1可拟合为F（t）=10.6+6.0cos（45t+180），转录Per2可拟合为F（t）=7.5+5.0cos（15t+180）；HL-60细胞转录Bmal1可拟合为F（t）=18.9+3.5cos（22.5t+180），转录Per2可拟合为F（t）=7.0+3.6cos（15t+240）；Raji细胞转录Per2可拟合为F（t）=9.6+3.6cos（15t+180）；3.通过余弦函数可知OCI-LY8的Bmal1基因转录水平大致以24小时为波动周期，其峰值时段和谷值时段分别位于ZT0和ZT12，Per2基因的转录水平大致以16小时为波动周期，其峰值时段和谷值时段分别位于ZT12和ZT4；Hut-78细胞的Bmal1基因转录水平大致以8小时为波动周期，其峰值时段和谷值时段分别位于ZT4和ZT8，Per2基因的转录水平大致以24小时为波动周期，其峰值时段和谷值时段分别位于ZT12和ZT0；HL-60细胞Bmal1基因的转录水平大致以16小时为波动周期，其峰值时段和谷值时段分别位于ZT0和ZT8，Per2基因的转录水平大致以24小时为波动周期，其峰值时段和谷值时段分别位于ZT8和ZT20；Raji细胞Per2基因的转录水平大致以24小时为波动周期，其峰值时段和谷值时段分别位于ZT12和ZT0；结论1.体外培养条件下可通过血清休克法诱导生物钟基因Bmal1和Per2在弥漫大B细胞淋巴瘤OCI-LY8细胞系、人皮肤T淋巴瘤Hut-78细胞系、髓系白血病HL-60细胞系中转录水平上的节律性表达及Per2在人伯基特淋巴瘤Raji细胞系中转录水平的节律性表达,而不能诱导Bmal1在人伯基特淋巴瘤Raji细胞系中转录水平的节律性表达。2.生物钟基因Bmal1与Per2在多种血液系统肿瘤细胞内转录水平上的节律性表达规律依细胞种类不同而有差异。但均可用余弦函数进行大致的描述。