围产期缺氧缺血(hypoxia ischemia，HI)是造成新生儿脑损伤的首要原因。尤其在早产儿形成一种区别于足月儿和成年人的独特病变--择性脑白质损伤。病理改变包括脑室周围白质软化(periventricular leukomalacia，PVL)和弥散性脑室周围白质损伤(periventricular white matter injury，PWMI)。后者发生率为前者10倍，以髓鞘减少或髓鞘形成延迟为主要病理特征。近年来，随着新生儿救护技术的提高，早产儿存活率显著增加，PWMI及由此产生的远期神经学后遗症发生率明显上升，给家庭和社会造成巨大负担。少突胶质前体细胞(oligodendrocytc precursor cells，OPCs)损伤是PWMI形成的主要原因和中心环节。未成熟脑白质中对缺氧缺血高度敏感的OPCs的大量死亡以及分化发育障碍是PWMI形成的关键。因此，深入研究OPCs缺氧缺血性损伤机制，是阐明早产儿脑白质损伤机理，寻找预防和治疗药物，降低早产儿死亡率和致残率的重要途径。迄今为止，对OPCs缺氧缺血损伤机制所知有限，可能与谷氨酸兴奋毒性、炎症介质、氧化应激、细胞内Ca2+超载等多种因素有关。然而针对这些机制的干预措施并未转化为临床治疗成果。 ATP是一种重要的神经递质，通过激活嘌呤能受体P2X和P2Y发挥多种作用。P2X7R是嘌呤能受体P2X家族中非常独特的一个亚类，为双功能受体，主要在病理条件下活化。现有的研究表明，P2X7R在胶质细胞具有广泛多样的效应，对病理状态下多个信号通路具有关键的调节作用，提示P2X7R可能处于神经胶质信号过程中相当上游的调节位点，通过调节递质释放、炎症反应、细胞凋亡和增殖，在胶质变性及随后的修复过程中起重要作用。被认为是缺血再灌注损伤，Alzheimer’s病，脊髓损伤和神经性疼痛等疾病潜在的治疗靶点。 对于P2X7R在神经胶质病理中的作用，至今还有许多未涉足的领域。新近报道P2XTR拮抗剂能改善疾病模型中的O4+少突胶质细胞凋亡和脱髓鞘病变，提示P2X7R在少突胶质系细胞损伤过程中可能具有重要作用。然而目前对于P2X7R与OPCs的关系尚所知甚少。在预实验中我们发现，离体培养的OPCs呈P2X7R免疫阳性。那么，OPCs表达的P2X7R是否具有功能?受体活化产生什么样的生物学效应?是否参与OPCs缺氧缺血性损害或防御过程?为解决这些问题，首先，我们在原代纯培养的OPCs上检测P2X7R表达和功能效应；其次，观测氧葡萄糖剥夺后P2X7R在OPCs表达的变化以及激动剂、拮抗剂对OPCs缺氧缺血性损伤的干预效应；第三，为在更完整的系统中了解受体表达，建立P3大鼠缺氧缺血性脑损伤模型，观察P2X7R在正常未成熟脑组织不同脑区的表达及HI后的变化。得出如下结果： 一、少突胶质前体细胞的培养和鉴定 1.混合胶质细胞的培养采用机械分离法；以振荡分离法和差速贴壁法分离纯化OPCs；加入促进神经细胞存活的营养因子N2及促进增殖的细胞因子PDGFa和bFGF，获得数量较多的OPCs，通过NG2鉴定，培养细胞纯度在90％以上，并且具有向成熟少突胶质细胞分化的潜能。OPCs分离纯化的完成为以OPCs为研究对象的实验提供基础和保障。 2.采用膜片钳技术证明OPCs具有独特电生理特性：输入阻抗(Ra)相对较高；电压依赖的K+电流具有外向整流特性；对TTX敏感的小的内向Na+流，不能产生动作电位。电生理特性测定也是对OPCs进行鉴定的可靠方法之一。 二、P2X7R在少突胶质前体细胞的表达以及受体活化后的功能效应 1.通过RT-PCR、Western blot和免疫荧光双标技术，从基因和蛋白水平证明离体培养的OPCs表达P2X7R； 2.100μM BzATP诱导[Ca2+]i显著升高，药理学特性与P2X7R符合：用含EGTA的无钙溶液可以显著降低钙反应振幅，提示[Ca2+]i升高依赖于细胞外Ca2+，该效应由P2X受体介导；BzATP(100μM)诱导的钙信号平均振幅显著高于ATP(100μM)；100nM BBG预处理几乎完全抑制BzATP诱导的钙反应。说明在激动剂刺激下，P2X7R活化介导Ca2+内流，使得[Ca2+]i升高。 3.染料负载实验中，300μM BzATP刺激，OPCs的荧光光密度较对照明显增加，300nM BBG预孵育可显著抑制此效应。提示高浓度BzATP诱导离体培养OPCs形成高通透性的质膜孔道，这一过程由P2X7R介导。 4.BzATP(100μM)刺激后，OPCs培养基中LDH释放量显著升高，提示BzATP对OPCs具有细胞毒性效应，造成急性细胞损伤。BBG(10.nM)预孵育明显抑制BzATP引起的LDH释放量升高，提示BBG可以明显减轻BzATP的细胞毒性效应，增加细胞存活。 三、P2X7R在少突胶质前体细胞缺氧缺血性损伤中作用的初步研究 1.OGD后2 h，近40％OPCs死亡。OGD前预先给予BBG(100nM)起到部分保护作用；OGD条件下，BzATP加重OPCs缺氧缺血性损伤，并且这种增强的毒性作用不能被BBG拮抗。提示OPCs对HI十分敏感；P2X7R特异性浓度的BBG对OPCs缺氧缺血性损伤具有部分保护效应，提示P2X7R活化参与OGD造成的OPCs损害； 2.RT-PCR和Westernblot显示，OGD后2h，P2XTRmRNA和蛋白表达迅速下调，从另一个角度提示P2X7R可能在OPCs缺氧缺血性损害过程中发挥作用。 四、P2X7R在新生大鼠脑组织的表达及在缺氧缺血性脑损伤后的变化 1.Western blot分析显示，由P0～P28，大鼠海马、皮层、白质P2X7R蛋白表达呈上升趋势。 2.通过RT-PCR、Western blot分析，从基因和蛋白水平证明P3大鼠海马、皮层、白质表达P2X7R；免疫荧光双标技术显示在海马、皮层和白质，部分NG2+ OPCs表达P2X7R；同时，皮层、海马有大量P2X7R免疫阳性神经元，主要表达于细胞胞体。 3.P3大鼠单侧颈总动脉结扎，吸入8％氧2h建立缺氧缺血性脑损伤模型，HI后2h，患侧海马、皮层和白质P2X7R免疫反应均减弱，P2XTRmRNA和蛋白水平迅速下调；胼胝体NG2+/P2X7R+细胞数量减少。HI后P2X7R表达下调，提示P2X7R可能参与未成熟脑组织缺氧缺血性损伤过程，但其具体作用和机制尚有待于进一步研究。 本实验首先建立离体纯培养OPCs模型，证明OPCs表达功能性P2X7R，受体活化介导Ca2+内流，质膜孔道形成和OPCs死亡。离体培养的OPCs对OGD高度易损，P2X7R拮抗剂BBG能明显减轻OPCs缺氧缺血性损伤。缺氧缺血后早期，离体培养的OPCs、缺氧缺血性脑损伤模型大鼠患侧大脑皮层、皮质下白质和海马P2X7R表达均出现下调。这些结果提示P2X7R参与缺氧缺血性脑白质损伤过程。