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黄精有补中益气、滋润心肺、强筋壮骨等功能,但生黄精辛辣,刺激咽喉,引发过敏反应,而九蒸九晒黄精入口甘甜,无刺激性和致敏性。“九蒸九晒”炮制将改变黄精化学成分,去除致敏性物质,消除其毒性,增强其疗效。目前致敏性化学物质的确定及其分离纯化研究不深入,缺乏致敏物质生物活性和药理研究。本课题采用超声辅助提取法提取黄精化学物质,结合HPLC获得黄精HPLC指纹图谱,确定黄精“九蒸九晒”炮制前后差异性化学物质,采用组合分离技术(大孔树脂联用制备色谱)分离纯化差异性化学物质,利用“四大光谱”(核磁、质谱、紫外、红外)解析鉴定刺激性化学物质结构。实验结果如下:(1)超声辅助提取中最佳溶剂为乙醇;(2)黄精HPLC指纹图谱分析参数确定为Ultimate XB-C18,5μm,4.6×250mm色谱柱;进样浓度 0.0088 g/mL,进样20uL,检测波长281nm,柱温35℃,流速1.0mL/min;洗脱剂A:0.1%甲酸-水,洗脱剂B:乙腈;梯度洗脱程序:0～5min98%～70%A,5～20min70%～40%A,20～25min40%～25%A,25～30min25%～0%A,30～40 min 0%A;(3)黄精“九蒸九晒”炮制前后主要差异性化学物质在HPLC分析柱中保留时间分别约为:16.59 min、17.10min、18.30 min、19.26 min、21.08 min、22.00 min、23.63 min、25.61 min;(4)D101型大孔树脂初分差异性化学物质工艺参数为:1 Bv的20%乙醇-水溶液上柱(浸膏浓度为0.5 g生药/mL),室温下分别以2Bv、流速为2 Bv/h的20%乙醇-水、40%乙醇-水、60%乙醇-水、80%乙醇-水、100%乙醇溶液洗脱,各个浓度洗脱液分别接样,经HPLC检测差异性化学物质主要截留在80%乙醇-水洗脱液中,浓缩得到的浸膏作为制备色谱的原料;(5)制备色谱精制差异性化学物质工艺参数为Ultimate XB-C18,10μm,21.2×250 mm色谱柱;进样浓度0.02 g/mL,进样5 mL,检测波长281 nm,柱温35℃,流速10.0mL/min;洗脱剂A:0.1%甲酸-水,洗脱剂B:乙腈;阶跃式梯度洗脱程序:0～70min70%A,70～115min 60%A;分部接样程序:0～13min,13～22 min,22～36min,36～59 min,59～69 min,69～88min,88～99min,99～114min;经 HPLC 分析,制备色谱保留时间 99～114min 的样品为纯物质,对应HPLC指纹图谱中保留时间约为23.63 min,同时此物质也是黄精“九蒸九晒”炮制后含量损失最大的化学物质;(6)“四大光谱”解析制备色谱保留时间99-114min的样品,得知化学式为C18H18O5,名称为4’,5,7-三羟基-6,8-二甲基高异黄烷酮。本课题利用HPLC确定黄精“九蒸九晒”炮制前后差异性化学物质,创新采用绿色组合分离技术分离纯化差异物质,工艺简单且成本低,为致敏物质的确定及其生物活性和药理研究做充足准备,有助于加快中药国际化与现代化发展。