论文部分内容阅读
目的:
p53蛋白是重要的抑癌蛋白之一。ASPP(Apoptosis-stimulating protein of p53)家族是近年来发现的能特异调控p53的因子,其中iASPP(inhibitory member of the ASPPfamily)是p53蛋白的抑制子(inhibitor)。由于在野生型p53细胞中,iASPP抑制细胞凋亡的机制是通过抑制p53激活前凋亡基因的转录活力,从而影响细胞凋亡的。那么,在p53缺失细胞中,iASPP又是如何影响细胞凋亡的呢?为了阐明iASPP在p53缺失细胞中影响细胞凋亡的机制,本研究构建了Bax-Luc、Puma-Luc报告基因,调查了iASPP、干扰iASPP、p63、p73等对凋亡基因转录能力的影响,探讨iASPP影响前凋亡基因的转录机制,阐明不依赖于p53的凋亡通路中影响凋亡的作用因子。
方法:
1.在p53缺失细胞H1299中转入iASPP干扰质粒,用G418筛选制备稳定转染细胞株,用Annexin V-FITC方法在流式细胞仪上检测细胞凋亡的变化。
2.采用PCR技术从人HepG2细胞中扩增出Bax/Puma启动子的DNA片断,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,测序确定所扩增的DNA序列,并将其转染入H1299细胞中检测其活性。
3.将报告基因、iASPP质粒和iASPP干扰RNA质粒分别转染入H1299细胞,48小时后测定荧光素酶的荧光读数,计算荧光读数增加或减少的倍数。
4.将报告基因、p63质粒、p73质粒和对照质粒分别转染入H1299细胞,48小时后测定荧光素酶的荧光读数,计算荧光读数增加的倍数。
5.在体外转录,翻译偶联系统中分别表达iASPP、p63、p73,再用免疫共沉淀和Western blot方法观察iASPP与p63和p73之间的相互作用。
6.用细胞转染、免疫沉淀和Westernblot技术研究iASPP与p63和p73在细胞内的相互作用。
结果:
1.在p53缺失细胞H1299中,iASPP具有抑制细胞凋亡的能力,但其机制不是通过p53通路,而是不依赖于p53的其他通路。
2.成功构建了人Bax/Puma启动子荧光素酶报告基因,并通过细胞内活性的检测证明了所构建报告基因载体的有效性。
3.H1299细胞转入iASPP后前凋亡基因Bax和Puma的转录能力下降;H1299细胞转入iASPP干扰质粒后前凋亡基因Bax和Puma的转录能力增强。
4.p63和p73转染H1299细胞后,前凋亡基因Bax和Puma启动子的转录能力增强。
5.iASPP与p63、p73在体外和细胞内存在着相互作用。
6.干扰iASPP后p63和p73的蛋白表达水平不变。
结论:
1.在p53缺失细胞H1299中,存在着一条不依赖于p53的细胞凋亡通路。
2.在p53缺失细胞H1299中,iASPP具有抑制前凋亡基因转录能力的功能。
3.在p53缺失细胞H1299中,p63、p73可以促进前凋亡基因的转录活力。
4.iASPP与p63、p73在体外和细胞内存在着相互作用。
5.iASPP不影响p63和p73的蛋白表达水平。
6.在p53缺失的H1299细胞中,iASPP可能是通过抑制p63/p73的转录因子功能,从而影响前凋亡基因Bax、Puma等的转录活力,进而导致细胞凋亡变化的。