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前言与目的肝衰竭是由多种因素引起的肝细胞严重损害,导致其合成、解毒和生物转化等功能发生严重障碍,常可发生多器官衰竭、肝性脑病、脑水肿、继发感染、凝血障碍、血液动力学紊乱以及各种肾脏和代谢的并发症。大量的研究已经证明,肝衰竭时细胞因子明显增高,如肿瘤坏死因子(TNF-α)、γ-干扰素(Interferon, IFN-y)、白细胞介素(Interleukin, IL)等均有细胞毒作用,可直接引起组织水肿和破坏。同时还可通过破坏细胞间紧密连接引起肠粘膜损伤,导致肠粘膜通透性增高。而肠粘膜通透性增高与内毒素血症、自发性腹膜炎(SBP)及肝性脑病等密切相关。目前,大多数研究认为肝衰竭时异常升高的细胞因子通过一定机制影响或者破坏了肠粘膜上皮细胞间的连接复合体,导致肠粘膜通透性增高。肠粘膜通透性明显升高时,一些细菌毒素、细菌、大分子物质都可以穿过肠屏障进入血液或者腹腔。穿透肠屏障的这些物质与内毒素血症、自发性腹膜炎以及肝性脑病的发生密切相关。而这些并发症又会加重肝衰竭病人的病情。所以很有必要研究肠通透性增高的机制,阻断肠通透性增高对于治疗肝衰竭和防止并发症具有重要的临床意义。材料与方法一、试剂TNF-α、LPS、D-GalN、Occludin抗体、Claudin-1抗体、FITC标记山羊抗兔IgG抗体、抗TNF-α-IgG抗体、D-乳酸标准品、D-乳酸脱氢酶。二、动物雄性BALB/C小鼠,6—8周龄,体重18～22克。三、方法(一)动物模型制备1、实验动物分组一：经过严格的动物预实验后,取60只雄性BalB/C小鼠,动物随机分为6组(第1组5只,第2组5只,第3组6只,第4组14只,第5组15只,第6组15只),第1组动物注射NS,同时后5组动物均腹腔注射LPS和D-GalN,制成肝衰竭模型。在注射后,间隔时间分别为Oh、2h、6h、9h、12h和24h,按组次处死动物,取血测定D-乳酸浓度,并且绘制时间与浓度关系曲线图,确定血浆D-乳酸浓度最高的时间点。2、实验动物分组二：经过严格的动物预实验后,再取45只雄性BalB/C小鼠,动物随机分为7组,第1组(生理盐水对照组)5只,第2组(LPS对照组)5只,第3组(D-GalN对照组)5只,第4组(TNF-α对照组)5只,第5组(LPS+D-GalN实验组)10只,第6组(D-GalN+TNF-α实验组)10只,第7组(LPS+D-GalN+TNF-α抗体实验组)5只。注射后,在血浆D-乳酸浓度最高的时间点,处死各组动物,取血测D-乳酸浓度。3、用药：D-氨基半乳糖(D-GalN) 800 mg/kg,内毒素(LPS) 10μg/kg,生理盐水,均为腹腔注射；TNF-α(10μg／kg),抗TNF-α-IgG抗体(100μg／只),均通过尾静脉注射。(二)血清D-乳酸浓度测定用分光光度法测定血清D-乳酸浓度。(三)透射电镜透射电镜下观察暴发性肝衰竭小鼠肠道粘膜上皮细胞形态学改变。(四)实时定量PCR检测实时定量PCR检测暴发性肝衰竭小鼠肠道粘膜上皮细胞紧密连接蛋白OccludinmRNA、Claudin-1 mRNA的表达水平。(五)Western blot方法蛋白杂交印记技术检测暴发性肝衰竭小鼠肠道粘膜上皮细胞紧密连接蛋白Occludin、Claudin-1的表达水平。(六)免疫组化检测免疫组织化学技术：用石蜡切片检测暴发性肝衰竭小鼠肠道粘膜上皮细胞Occludin、Claudin-1的表达变化。(七)数据处理结果用平均数±标准差表示,并采用方差分析的方法,以P<0.05为差异具有显著性。结果1、血清D-乳酸含量的测定通过检测血清D-乳酸的含量发现,暴发性肝衰竭小鼠血清中D-乳酸的浓度6小时达最高。应用TNF-α抗体加以保护,结果示,抗体组与坏死组有差异,抗体组与生理盐水对照组无差异。2、透射电镜透射电镜下观察暴发性肝衰竭小鼠肠道粘膜上皮细胞紧密连接,发现坏死组紧密连接断裂破坏,而正常组与抗体保护组紧密连接完整。3、肠组织Occludin mRNA、Claudin-1 mRNA的表达(1)暴发性肝衰竭小鼠6小时组(P<0.05)、9小时组(P<0.01)、12小时组(P<0.01)的Occludin mRNA与0小时组相比较,有统计学差异,且9小时组表达最低。而预先给予TNF-α抗体,6小时时点对各组动物Occludin mRNA进行比较,发现LPS/D-GalN组、D-GalN/TNF-α组与NS对照组具有统计学差异(P<0.01, P<0.01)组、D-GalN/TNF-α组与TNF-α抗体组具有统计学差异(P＜0.01, P<0.01)组与D-GalN/TNF-α组之间无统计学差异(P=0.947)；TNF-α抗体组与NS对照组无统计学差异(P=0.509)(2)暴发性肝衰竭时6小时组(P<0.05)、9小时组(P<0.05)的Claudin-1 mRNA与0小时组相比较,有统计学差异,9小时组表达最低。而预先给予TNF-α抗体,6小时时点对各组动物Claudin-1 mRNA进行比较,发现LPS/D-GalN组、D-GalN/TNF-α组与NS对照组具有统计学差异(P＜0.01, P＜0.01), LPS/D-GalN组、D-GalN/TNF-α组与TNF-a抗体组具有统计学差异(P＜0.05,P＜0.01),LPS/D-GalN组与D-GalN/TNF-α组之间无统计学差异(P=0.584), TNF-α抗体组与NS对照组无统计学差异(P=0.532)。4、肠组织Occludin、Claudin-1蛋白的表达(1)通过Western Blot对Occludin蛋白的表达进行分析,发现暴发性肝衰竭时6小时组(P＜0.05)、9小时组(P＜0.01)、12小时组(P＜0.01)的Occludin蛋白含量与0小时组相比较,有统计学差异,且9小时组含量最少。而预先给予TNF-α抗体,6小时时点对各组动物Occludin蛋白含量进行比较,发现NS对照组与LPS/D-GalN组、D-GalN/TNF-α组、TNF-α组之间均有统计学差异(P＜0.01,P＜0.01, P<0.01), TNF-α抗体组与LPS/D-GalN组、D-GalN/TNF-α组之间具有统计学差异(P<0.01, P<0.01), LPS/D-GalN组与D-GalN/TNF-α组之间无统计学差异(P=0.120), TNF-α抗体组与NS对照组无统计学差异(P=0.10)。(2)通过Western Blot对Claudin-1蛋白的表达进行分析,发现暴发性肝衰竭时6小时组(P＜0.01)、9小时组(P＜0.01)的Claudin-1蛋白含量与0小时组相比较,有统计学差异,且9小时组含量最少。而预先给予TNF-a抗体,6小时时点对各组动物Claudin-1蛋白含量进行比较,发现NS对照组与LPS/D-GalN组、D-GalN/TNF-α组、TNF-α组、LPS组之间均有统计学差异(P＜0.01,P＜0.01,P＜0.05, P＜0.05); TNF-α抗体组与LPS/D-GalN组、D-GalN/TNF-α组之间具有统计学差异(P<0.01, P<0.01); LPS/D-GalN组与D-GalN/TNF-α组之间无统计学差异(P=0.177); TNF-α抗体组与NS对照组无统计学差异(P=0.148)。5、肠组织Occludin、Claudin-1蛋白的免疫组化染色：利用免疫组化方法检测,在NS组的大肠组织切片中可见Occludin蛋白沿肠粘膜上皮细胞膜顶端棕揭色表达很强的阳性染色信号。LPS/D-GalN 6h组、D-GalN/TNF-α6h组、LPS/D-GalN 9h组发现肠粘膜上皮细胞间顶端棕褐色阳性染色明显减弱。经过TNF-α抗体预先进行阻断后,TNF-α抗体组大肠组织内阳性信号与正常对照组比较无明显变化。在NS组的大肠组织切片中可见到Claudin-1蛋白沿肠粘膜上皮细胞膜顶端棕揭色表达很强的阳性染色信号。LPS/D-GalN 6h组、D-GalN/TNF-α6h组、LPS/D-GalN 9h组发现肠粘膜上皮细胞间顶端棕褐色阳性染色明显减弱。经过TNF-α抗体预先进行阻断后,TNF-α抗体组大肠组织内阳性信号与正常对照组比较无明显变化。提示通过阻断TNF-α的作用,可以阻止Occludin蛋白、Claudin-1蛋白分布的减少。结论1、暴发性肝衰竭小鼠血清D-乳酸水平增高,说明肠粘膜通透性增加,而TNF-α抗体加以预保护可阻断肠粘膜通透性增加,证明TNF-α可以促使暴发性肝衰竭小鼠肠粘膜通透性增加。2、暴发性肝衰竭小鼠肠组织Occludin蛋白、Claudin-1蛋白表达较生理盐水组明显下降,而TNF-α抗体加以预保护可阻止暴发性肝衰竭小鼠肠组织Occludin蛋白、Claudin-1蛋白表达的下降,说明暴发性肝衰竭小鼠肠粘膜通透性增加的机制可能是TNF-α降低了肠组织Occludin蛋白、Claudin-1蛋白的表达。