【摘 要】
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胰高血糖素样肽1（Glucagon-Like Peptide-1,GLP-1）是由肠道内分泌型L细胞分泌的多肽,具有调控胰岛素分泌,刺激胰腺β细胞再生的作用,是开发糖尿病药物的重要靶标。目前作为二型糖尿病药物其类似物已上市,但普遍存在的问题是:价格昂贵,只能皮下注射,长期用药依从性不高。因此筛选小分子GLP-1类似物是今后发展的主要方向之一。但当前GLP-1受体激动剂的细胞筛选技术多是利用GLP-
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胰高血糖素样肽1（Glucagon-Like Peptide-1,GLP-1）是由肠道内分泌型L细胞分泌的多肽,具有调控胰岛素分泌,刺激胰腺β细胞再生的作用,是开发糖尿病药物的重要靶标。目前作为二型糖尿病药物其类似物已上市,但普遍存在的问题是:价格昂贵,只能皮下注射,长期用药依从性不高。因此筛选小分子GLP-1类似物是今后发展的主要方向之一。但当前GLP-1受体激动剂的细胞筛选技术多是利用GLP-1与其受体激活后,通过检测激活后细胞内环磷酸腺苷（cAMP）水平变化来筛选,由于细胞内引起cAMP水平变化的因素较多,因此该系统无法高效地对大量的天然产物进行有效筛选。因此,通过现代标记技术开发高效的GLP-1R细胞筛选模型意义十分重大。本研究将充分利用云南省丰富的天然产物资源,通过直接标记GLP-1R的方法建立稳定的荧光标记细胞株。该技术不仅可实现对复杂天然产物进行筛选,而且专一性高,可显著降低筛选中假阳性的发生。本文利用pCMV6-AC-GFP构建了 GLP-1R绿色荧光蛋白（GFP）真核表达载体GLP-1R/pCMV6,经转染人骨肉瘤U20S细胞后,通过抗性筛选和流式细胞分选,显微成像表明标记的GLP-1R已正确定位于重组细胞膜上,该细胞系连续传代10代以上,通过Western-bloting进行了验证,其GLP-1R的表达量在代间没有明显差异,最终获得了能稳定表达荧光标记GLP-1R的细胞系GLP-1R/U20S,随后对该细胞系的生物学功能也进行了验证,在加入阳性对照物Exendin-4后在GLP-1R/U20S细胞上观察到显著的受体配体结合反应。利用该阳性对照物检测了该细胞株与阳性产物的反应时间及量效依存关系,结果表明:重组细胞在激动剂存在下,细胞在不同时间内均会产生荧光斑点,20min时产生斑点数最多,且未发生内吞,因此最佳检测时间为20min。在加入不同浓度的Exendin-4激活GLP-1R/U20S细胞株后,可以得到量效关系曲线,在1.6×10-10 mol/L到1 × 10-5mol/L之间呈良好的线性关系,经计算其EC50为46nM。用抑制剂Exendin9-39处理后,加入相同浓度的Exendin-4作用60min,细胞株荧光斑点平均强度得到明显抑制,表明细胞模型也适用于抑制剂的筛选。本研究成功构建了 GLP-1R/pCMV6真核表达载体,建立了稳定转染的U20S细胞系,并验证了其功能。整个检测方法易标准化,重复性好,受体特异性高、成本低,初步实现了对肽类和非肽类的GLP-1类似物进行高通量筛选的可能,具有良好的应用前景。
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