研究背景糖皮质激素性骨质疏松症(Glucocorticoid-induced osteoporosis,GIO)是临床上长期使用糖皮质激素(Glucocorticoid,GC)导致的最常见和严重的不良反应之一,患者由于骨量减少、骨微结构破坏、骨脆性增加,易引发骨折及其他严重并发症,造成巨大的医疗负担。GIO发病率高,位居骨质疏松症(Osteoporosis,OP)第三位,仅次于绝经后骨质疏松症及老年性骨质疏松症;但目前防治GIO仍基本采用治疗原发性骨质疏松症的药物,未见特异性针对GIO的有效防治措施。近年来,骨髓脂肪分化和氧化应激(Oxidative stress,OS)作为GIO的两个重要危险因素已经引起广泛的关注。众多研究表明,当人体衰老或处于某种疾病状态以及服用某些药物如GC时,一方面骨髓脂肪分化,骨髓腔中脂肪堆积,另一方面活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)在机体内大量积聚,诱发OS,最终导致OP。这提示应用具有抗氧化活性和抑制骨髓脂肪分化的物质有可能是防治GIO的新靶点。本课题组前期研究发现,天然抗氧化多酚酸类小分子丹参素和丹酚酸B在体外可促进成骨细胞(Osteoblast,OB)的增值、分化和矿化;以丹参素和丹酚酸B为主要成分的丹参水提物对GC诱发的大鼠骨丢失及骨髓脂肪分化有防治作用;进一步研究发现丹参素能通过调控FoxO/Wnt信号通路对抗H202所致OS对成骨细胞分化的抑制。这些提示丹参素和丹酚酸B可能对GC所致骨组织损害具有保护作用,但其是否具有防治GIO的作用,尚需进一步的整体动物实验研究。因此,本研究以丹参素、丹酚酸B为研究对象,分别采用斑马鱼和SD大鼠复制GC所致骨生成抑制模型和GIO模型,探讨不同剂量的丹参素和丹酚酸B及两者的混合物对实验性GIO的防治作用;并结合不同剂量的丹参素在大鼠体内的血药浓度及曲线下面积,研究丹参素的药效学与剂量的关系;同时初步探讨丹参素和丹酚酸B抗GIO作用与骨髓脂肪分化和OS的关系,为丹参素、丹酚酸B作为抗GIO新药的研发和临床应用提供实验依据。研究目标1.基于模式动物斑马鱼、SD大鼠研究丹参素、丹酚酸B对GIO的防治作用。2.观察不同剂量的丹参素和丹酚酸B及两者的混合物对GIO的量效关系,并从PK/PD角度探讨丹参素合适的给药剂量范围。3.进一步探讨丹参素和丹酚酸B通过抗骨髓脂肪分化及清除ROS对抗OS而产生抗GIO作用,为小分子天然抗氧化物质防治GIO提供实验依据。研究方法和内容1.丹参素和丹酚酸B对地塞米松致幼年斑马鱼骨生成抑制的作用以受精后3天(3 dpf)的野生型AB品系幼年斑马鱼和成骨细胞特异性表达绿色荧光蛋白的硬骨转基因品系tg(s7:egfp)幼年斑马鱼为研究对象,采用地塞米松处理和丹参素、丹酚酸B干预,共6天。9 dpf时结束实验,进行以下指标检测:野生型AB品系斑马鱼行茜素红染色,体视显微镜下拍照,定量分析幼鱼头部骨骼茜素红染色区域面积及累计光密度,观察头骨的矿化;tg(sp7:egfp)斑马鱼行激光共聚焦显微镜(Laser scanning confocal microscope,LSCM)扫描头部骨骼荧光、定量分析幼鱼头部骨骼绿色荧光面积及累计光密度,从而观察成骨细胞的分化和骨形成;qRT-PCR检测相关的成骨细胞特异性基因的表达水平;DCFH-DA荧光探针结合酶标仪荧光分析技术检测斑马鱼体内OS水平。主要内容如下:(1)观察不同浓度地塞米松对幼年斑马鱼头骨矿化和成骨细胞分化及骨生成的影响,建立糖皮质激素致幼年斑马鱼骨生成抑制模型。(2)观察不同浓度的丹参素、丹酚酸B对幼年斑马鱼骨生成的作用及对糖皮质激素所致幼年斑马鱼骨生成抑制的干预作用。(3)探讨丹参素、丹酚酸B对糖皮质激素性骨生成抑制斑马鱼的成骨细胞特异性相关基因表达水平及OS水平的调控作用。(4)分析丹参素、丹酚酸B对抗地塞米松致斑马鱼头骨形成抑制、调控成骨细胞特异性基因表达及对抗OS之间的关系,从而在整体动物水平进一步研究和验证丹参素、丹酚酸B对骨形成的促进作用及对GC致骨生成抑制的调控作用。2.丹参素和丹酚酸B对大鼠GIO的效应研究及丹参素在大鼠体内血药浓度2.1丹参素和丹酚酸B对大鼠实验性GIO的效应研究7月龄SPF级SD雌性大鼠100只(体重290±20g),按体重区组随机分为10组,每组10只。除基础组和对照组外,其余各组上午灌胃(p.o)丹参素和丹酚酸B等相应干预药物,下午均灌胃醋酸泼尼松6mg/5mL/kg/d(在以下分组中用GC代替),共计14周。(1)基础组(Bas,未用药,在实验开始即被处死取材作为基础对照);(2)对照组(Con,每日上下午均灌胃生理盐水,5mL/kg/d);(3)醋酸泼尼松造模组(GC,生理盐水5mL/kg/d+GC);(4)丹参素低剂量预防组(GC+T-L,丹参素 12.5mg/5mL/kg/d+GC);(5)丹参素中剂量预防组(GC+T-M,丹参素25mg/5mL/kg/d+GC),;(6)丹参素高剂量预防组(GC+T-H,丹参素50mg/5mL/kg/d+GC);(7)丹酚酸 B 预防组(GC+S,丹酚酸 B 25mg/5mL/kg/d+GC);(8)丹酚酸B+丹参素预防组(GC+T+S,丹酚酸B+丹参素12.5mg/12.5mg/5mL/kg/d+GC);(9)丹参素固体分散体预防组(GC+T-P,丹参素-固体分散体228mg/5mL/kg/d+GC,换算成丹参素为 25mg/5mL/kg/d,);(10)罗盖全预防组(GC+R,罗盖全 0.045μ g/5mL/kg/d+GC)。所有实验大鼠在实验结束(处死)前第14、13天及第4、3天分别于颈背部皮下注射钙黄绿素(8mg/kg)进行骨骼荧光标记。实验结束当天,大鼠称重、腹腔麻醉,心脏采血处死。取血清检测骨代谢及OS生化指标;摘取胸腺、肾上腺、胫前肌等脏器称湿重计算器官指数;分离左侧胫骨和第四腰椎(L4),利用Micro-CT技术检测骨组织显微三维形态结构参数后,取左侧胫骨脱钙、组织切片、HE染色,观察骨髓脂肪分化;取右侧胫骨上段、中段行不脱钙硬组织切片、染色,利用图像分析系统测定骨组织形态计量学动、静态参数;分离右侧股骨和第五腰椎(L5),双能X线骨矿物质密度检测仪(DXA)测定骨密度(BMD);分离左侧股骨,三点弯曲法检测股骨生物力学性能。主要研究内容如下:(1)建立SD雌性大鼠GIO模型,观察丹参素和丹酚酸B对GIO大鼠骨代谢、骨量、骨微结构及骨生物力学性能的影响。(2)比较不同剂量丹参素各干预组及丹酚酸B干预组对GIO大鼠骨生物学的影响,初步筛选丹参素及丹酚酸B对抗GIO的最佳给药剂量范围。(3)检测大鼠骨髓脂肪分化及血液中ROS和抗氧化标志物水平,观察丹参素和丹酚酸B对GIO大鼠骨髓脂肪分化和氧化应激的干预作用,在整体动物水平探讨丹参素和丹酚酸B防治GIO和抑制骨髓脂肪分化和抗氧化应激之间的关系。2.2不同剂量丹参素在大鼠体内的血药浓度及曲线下面积4月龄SD大鼠,单次灌胃以下不同剂量的丹参素:(1)丹参素12.5mg/5mL/kg(T-L),(2)丹参素 25mg/5mL/kg(T-M),(3)丹参素 50mg/5mL/kg(T-H),(4)丹参素固体分散体228 mg/5mL/kg(换算为丹参素25 mg/5mL/kg,T-P),(5)丹参素+丹酚酸B 12.5mg/12.5mg/5mL/kg(T+S)。LC/MS/MS测定丹参素血药浓度,并利用药代动力学专业软件DAS2.0分析数据,计算药代动力学参数,比较曲线下面积。结合上述不同剂量丹参素对抗大鼠GIO的效应,初步确定丹参素抗GIO的合适剂量和血药浓度。主要研究内容如下:(1)利用LC/MS/MS测定大鼠血清中丹参素的浓度。(2)利用DAS2.0药动学软件计算大鼠灌胃后丹参素的药代动力学参数,比较血药峰浓度和曲线下面积。(3)分析不同剂量丹参素对大鼠实验性GIO的防治作用与曲线下面积之间的关系,从PK/PD角度探讨丹参素抗GIO的合适剂量。3.统计分析:实验结果采用均数土标准差(x±s)表示,采用统计软件SPSS16.0对数据进行分析统计,组间比较采用one-way ANOVA,当p<0.05时表示组间差异有统计学意义。当方差齐性时,采用Fisher 1east significant difference(LSD)方法进行组间多重比较,否则采用DunnettT3进行组间多重比较。实验结果1.丹参素、丹酚酸B对地塞米松致幼年斑马鱼骨生成抑制的作用1.1地塞米松致幼年斑马鱼骨生成抑制模型建立茜素红染色和LSCM扫描结果表明,地塞米松(5-20μM)既可浓度依赖性地引起野生型AB品系幼年斑马鱼的头骨矿化面积和累计光密度降低(p＜0.05),也可浓度依赖性地引起tg(sp7:egfp)斑马鱼幼鱼头部骨骼的绿色荧光面积和累计光密度降低(p<0.05),说明地塞米松可通过降低骨的矿化和成骨细胞的分化,抑制斑马鱼头骨的生成。1OμM为地塞米松最合适的实验浓度。1.2丹参素、丹酚酸B对幼年斑马鱼骨生成的作用茜素红染色结果表明,丹参素(1-5μM)和丹酚酸B(0.5-2μM)均可引起野生型AB品系幼年斑马鱼的头骨矿化面积和累计光密度增加(P＜0.05),说明丹参素和丹酚酸B在较低浓度时均可促进斑马鱼头骨的矿化。与茜素红染色结果相一致,LSCM扫描结果表明,丹参素(1-5μM)和丹酚酸B(0.5-2μM)也均可使tg(sp7:egfp)斑马鱼幼鱼头部骨骼的绿色荧光面积和累计光密度增加(p<0.05),说明丹参素和丹酚酸B在较低浓度时也均可促进斑马鱼成骨细胞的分化。1.3丹参素、丹酚酸B对暴露于地塞米松的幼年斑马鱼骨生成的保护作用茜素红染色结果结合LSCM扫描结果表明,10μM地塞米松可明显引起幼年斑马鱼头骨矿化和成骨细胞分化的降低(p<0.05);而加入丹参素(2.5-50μμM)和丹酚酸B(0.5-10[μM)及丹参素与丹酚酸B混合物(质量比1:1)后,均可不同程度的对抗地塞米松引起的上述变化,5μM丹参素和2μM丹酚酸B的干预效果最明显(p<0.05)。1.4地塞米松对斑马鱼成骨细胞特异性相关基因表达和氧化应激的影响及丹参素、丹酚酸B的干预作用:(1)qRT-PCR检测结果表明,10μM地塞米松可引起斑马鱼成骨细胞特异性相关基因(alp、OC、runx2a、sp7)的表达水平明显降低(p<0.05),进一步说明地塞米松可抑制成骨细胞的分化和矿化,而5μM丹参素和2μM丹酚酸均可不同程度地对抗地塞米松引起的这些变化。(2)DCFH-DA荧光探针化学检测结果表明,10μM地塞米松处理后,斑马鱼体内ROS蓄积、MDA的水平升高(p<0.05),SOD、CAT和GSH的活性降低(p<0.05)说明地塞米松激活了斑马鱼体内氧化应激,而5μM丹参素、2μM丹酚酸B均可不同程度对抗上述变化,使ROS减少、MDA水平降低(p<0.05),虽可使SOD、CAT和GSH活性升高,但没有显著性差异(p>0.05)。综上所述,丹参水溶性多酚酸类小分子丹参素及丹酚酸B在低浓度时可刺激幼年斑马鱼骨的矿化和成骨细胞分化,促进骨生成;在较高浓度时,可对抗糖皮质激素所致骨生成抑制,其机制可能与清除ROS、降低OS及上调成骨细胞特异性相关基因的表达有关。2.丹参素和丹酚酸B对大鼠GI0的效应及不同剂量丹参素在大鼠体内血药浓度和曲线下面积2.1醋酸泼尼松对大鼠骨生物学的影响及丹参素和丹酚酸B的干预作用(1)DXA检测结果表明,与Con组比较,GC组大鼠股骨和腰椎的BMD明显降低(P<0.05),提示GC导致了大鼠骨量丢失。与GC组比较,丹参素或丹酚酸B各预防组大鼠股骨远端BMD明显增加,其中丹参素25mg/kg/d、丹酚酸B 25mg/kg/d预防组大鼠股骨BMD增加最显著(P<0.05),所有给药组分对GIO大鼠腰椎的BMD均无明显影响。(2)Micro-CT检测骨组织三维图像计量学结果表明,与Con组相比,GC组大鼠胫骨上段和腰椎的松质骨的BV/TV、BMD和Tb.Th均明显降低(P<0.05),SMI、Tb.Sp则明显升高(P<0.05),提示GC处理后,大鼠松质骨骨小梁稀疏变薄。与GC组相比,丹参素25mg/kg/d和丹酚酸B 25mg/kg/d预防组大鼠胫骨和腰椎的Tb.N、BV/TV、Tb.Th和BMD均显著增加(P<0.05),Tb.Sp和SMI显著减少(P<0.05),恢复到甚至超过Con组水平,其它丹参素各组对GIO大鼠骨微结构的恢复均不如丹参素25mg/kg/d。(3)骨组织形态计量学检测结果显示,GC导致大鼠胫骨上段松质骨:成骨细胞数目减少,成骨细胞周长百分率(%Ob.Pm)显著降低(P<0.05),单位骨小梁周长破骨细胞数(Oc.N)和破骨细胞周长百分率(%Oc.Pm)均呈上升的趋势,但无统计学意义(P>0.05);骨形成活动下降,骨矿化沉积率(MAR)、骨形成率(BFR/BS、BFR/BV、BFR/TV)、荧光周长百分数(%L.Pm)均显著降低(P<0.05),骨微结构受损,骨小梁数目减少(P<0.05),骨小梁稀疏变薄(P<0.05),骨小梁面积减小(P<0.05),骨小梁间距增大(P<0.05);同时GC也导致大鼠胫骨中段皮质骨骨外膜骨形成减少(P<0.05),骨内膜骨转换增高(P<0.05),使皮质骨骨量减少(P<0.05),骨髓腔增大(P<005)。丹参素或丹酚酸B能一定程度促进骨形成和矿化,修复GIO大鼠受损的松质骨和皮质骨结构,抑制骨量丢失,其中丹参素25mg/kg/d和丹酚酸B 25mg/kg/d修复作用最明显。(4)股骨三点弯曲试验结果表明,与Con组比较,GC组大鼠股骨的生物力学参数断裂载荷、最大载荷和弹性载荷及刚度系数均呈下降的趋势(P<0.05),表明GIO大鼠骨生物力学性能降低,骨折风险增加;丹参素和丹酚酸B能不同程度的使GIO大鼠上述生物力学参数增加,生物力学性能增强,尤其是丹参素25mg/kg/d预防组和丹酚酸B 25mg/kg/d预防组大鼠骨力学性能已达到Con组水平。(5)大鼠血清中骨代谢生化指标检测结果表明,与Con组比较,GC组大鼠血清中骨形成标志物BAP、OCN、PINP呈明显的下降趋势,但组内标准差大,差异均无统计学意义(P>0.05);丹参素和丹酚酸B可明显促进GIO大鼠骨形成标志物的增加,但组内标准差大,增加无统计学意义。GC和各药物组分对骨吸收标志物CTX-I、RANKL、TRACP-5b的改变不明显(P>0.05)。综上所述,GC导致了大鼠骨形成减少,骨量丢失,骨微结构受损、破坏,骨强度下降,骨折风险增加,诱发了 GIO。丹参素和丹酚酸B能不同程度的对抗GIO,以丹参素25mg/kg/d和丹酚酸B 25mg/kg/d效果最显著。2.2醋酸泼尼松对大鼠体重和器官、骨骼肌湿重的影响及丹参素和丹酚酸B的干预作用每天灌胃醋酸泼尼松6mg/kg 14周后,与Con组比较,GC组大鼠体重明显降低(P<0.05),胸腺、肾上腺和胫前肌湿重均减轻(P<0.05)。与GC组相比较,各药物干预组到实验结束,体重和器官肌肉湿重均有所恢复,其中丹参素中剂量组体重恢复几乎接近Con组水平(P>0.05)。2.3醋酸泼尼松对大鼠骨髓脂肪面积和血脂的影响及丹参素和丹酚酸B的干预作用与Con组比较,GC组大鼠胫骨上段骨髓腔脂肪细胞明显增多,脂肪面积百分数显著增加(P<0.05),提示GC可促进骨髓的成脂肪分化,这也是GC诱导GIO的一个重要原因。丹参素各组和丹酚酸B组大鼠胫骨上段骨髓腔中脂肪细胞显著减少,脂肪面积百分数较GC组均有不同程度的下降(P<0.05),尤其是丹参素25mg/kg/d预防组的脂肪面积百分数恢复至Con组水平,提示丹参素和丹酚酸B可抑制骨髓成脂肪分化,从而促进成骨分化。与骨髓脂肪变化相应,GC组大鼠血清中甘油三酯和低密度脂蛋白明显升高(P<0.05),高密度脂蛋白明显降低(P<0.05),提示GC导致大鼠血脂代谢紊乱,出现高脂血症。丹参素和丹酚酸B明显改善GIO大鼠的血脂代谢,降低血脂。2.4醋酸泼尼松对大鼠血清氧化应激相关指标的影响及丹参素和丹酚酸B的干预作用GC组大鼠血清中ROS水平比Con组显著升高(P<0.05),脂质氧化终产物MDA也显著增加(P<0.05),而SOD和CAT活性显著下降(P<0.05),提示GIO大鼠处于氧化应激状态;丹参素和丹酚酸B能对抗GC引起的上述变化,丹参素各组和丹酚酸B组ROS水平较GC组明显降低(P<0.05),MDA明显减少(P<0.05),CAT活性有所增加(P<0.05),丹参素高、中剂量组和丹酚酸B组的SOD活性也增加(P<0.05)。这些结果提示丹参素和丹酚酸B的抗GIO作用可能与清除ROS抗OS有关。2.5大鼠灌胃不同剂量的丹参素后,15min后均可在大鼠血清中检测到丹参素,60min时丹参素血药浓度达到顶峰,8h时丹参素已基本消除,说明丹参素灌胃后吸收分布快,消除较慢。高、中、低剂量的丹参素其血清药物浓度随时间变化的规律基本相一致。2.6丹参素血药时间数据经DAS2.0药动学软件处理后,主要药代动力学参数表明,不同剂量丹参素(T-L、T-M、T-H)及固体分散体(T-P)的t1/2为55～72min,Tmax除T-P外均为60min,但Cmax和AUC差异显著。随丹参素剂量的增加,T-L、T-M、T-H的Cmax和AUC显著增加,Cmax和AUC的比值分别为1:1.7:4.5和1:1.5:4.0,说明随着丹参素给药剂量的增加,吸收进入大鼠体内的丹参素的量也显著增加。与T-M相比,含相同剂量丹参素的T-P的Cmax和AUC显著增高,分别是T-M的3.3倍和3.2倍,提示丹参素固体分散体的生物利用度显著增加。丹参素+丹酚酸B混合物(T+S)与含相同剂量丹参素的T-L相比,丹参素的Cmax和AUC无明显变化,提示丹参素和丹酚酸B配伍合用对丹参素的血药浓度无明显影响。综上所述,不同剂量丹参素及其制剂和与丹酚酸B的混合物灌胃后丹参素的血药浓度及进入体内药物量均差异显著,其对大鼠GIO的防治作用也差异明显,其中丹参素中剂量组的效果最好,提示丹参素防治GIO的疗效与给药剂量和血药浓度密切相关,血药浓度过大和太小都不利于丹参素的疗效,25mg/kg/d为合适的给药剂量。结论:1.丹参素和丹酚酸B均可促进幼年斑马鱼骨生成,并呈浓度依赖性对抗糖皮质激素所致的骨生成抑制。2.丹参素和丹酚酸B能防治大鼠GIO;丹参素对GIO的保护作用与给药剂量和血药浓度有关,丹参素中剂量25mg/kg/d效应最佳。3.丹参素、丹酚酸B对抗GIO可能与清除GC诱导产生的过多ROS、对抗OS和抑制骨髓成脂肪分化,从而促进成骨有关。