目的脑出血(Intracerebral hemorrhage, ICH)是指非外伤性脑实质出血,是一种神经系统常见病、多发病,其致残率和死亡率均很高,严重影响人类的健康和患者的生存质量。ICH后脑水肿是脑损伤加重的主要原因之一,如果诱发脑疝还可导致患者死亡。目前的治疗方法仅局限于脱水治疗如高渗性脱水剂和利尿剂、外科手术减压治疗等,尚无特效治疗。内皮屏障抗原(Endothelial Barrier Antigen, EBA)是一种主要在具有血脑屏障(Blood-brain barrier,BBB)特性的毛细血管内皮细胞上特异性表达,由相对分子量分别为32kDa、25kDa和23.5kDa三个亚基组成的三聚体蛋白质。EBA在各种原因(如脑缺血、蛛网膜下腔出血、脑外伤等)引起的脑水肿形成中均起着重要的作用。本研究利用立体定向技术向大鼠尾状核内注入50 u L自体股动脉血建立脑出血模型,用免疫组化法检测脑出血后的血肿周围脑组织EBA和Fibrinogen动态表达变化、BBB的通透性及脑水含量的变化,探讨EBA在ICH后是否在脑出血后血肿周围脑组织表达及分布；EBA在ICH后脑水肿形成中的作用机制；从而探讨在脑出血后继发损伤(主要指脑水肿)中的作用。材料与方法一、材料1、动物分组选择健康雄性Sprague Dawley大鼠150只,体重250-300g,随机分成(1)正常对照组(2)假手术对照组(3)生理盐水对照(4)脑出血实验组,(3)(4)组分别按6h、1d、3d、7d分为4个亚组,每个亚组15只大鼠。2、主要仪器动物头颅立体定位仪、电子分析天平、显微图像分析仪、紫外分光光度仪、微量进样器、高温干燥箱、组织匀浆机、电泳仪、凝胶成像分析系统。3、主要试剂伊文思兰、甲酰胺、EBA兔抗鼠多克隆抗体、Fibrinogen羊抗鼠多克隆抗体、即用型SABC免疫组化试剂盒、DAB试剂盒三羟甲基氨基甲烷(Tris)、丙烯酰胺(Acr)、甲醇。4、大鼠脑出血模型制作用微量注射器抽取70uL大鼠自体股动脉血。立即将大鼠俯卧位于脑立体定位仪上,于前囟前0.2mm,中线右旁3.0mm,进针约6mm(大鼠尾状核处),将大鼠自体股动脉血50uL缓慢推注入脑。生理盐水对照组注入50uL生理盐水。假手术对照组钻孔不进行注射。正常对照组不予任何处置。5、标本制作(1)取各组5只大鼠于术后相应时间点麻醉,断头取脑,进行脑组织水含量测定和BBB通透性测定。(2)取各组5只大鼠于术后相应时间点麻醉开胸,迅速暴露心脏,4%多聚甲醛灌注固定,取脑,样本置于4%多聚甲醛外固定4小时,酒精脱水,二甲苯透明,浸蜡,包埋。连续冠状切片,片厚5um,进行切片HE染色和免疫组化染色。(3)取各组5只大鼠于术后相应时间点麻醉,断头取脑,进行Fibrinogen蛋白Western Blot检测。二、检测指标1、脑组织水含量测定取大鼠出血侧针孔前侧脑组织,按照干湿重法测定脑水含量,计算公式为：脑组织含水量(%)=(湿重-干重)／湿重×100%。以脑组织水含量代表脑水肿的程度。2、BBB通透性测定取大鼠出血侧针孔后侧水肿区脑组织,按Belayev法使用伊文思兰(Evens blue,EB)测定BBB通透性。用EB含量(OD/mg)表示BBB通透性。3、EBA蛋白、Fibrinogen蛋白表达免疫组化检测SABC法进行EBA蛋白、Fibrinogen蛋白表达阳性细胞测定。切片经过热修复后滴加50uL一抗工作液(兔抗鼠多克隆EBA抗体,稀释度1：200、羊抗鼠多克隆Fibrinogen,稀释度1：50),4℃过夜；然后滴加生物素化山羊抗兔IgG,过氧化物酶标记兔抗羊IgG,37℃30min；滴加SABC,37℃30min,各步骤用PBS洗3 min×3次；DAB显色剂,苏木素轻度复染,脱水、透明、封片。显微图像分析系统采集图像,分析阳性细胞积分光密度。4、Fibrinogen蛋白Western Blot检测取出标本100mg低温提取蛋白,SDS-PAGE分离样品。转膜,封闭,加一抗(羊抗鼠多克隆Fibrinogen,稀释度1：100)孵育,洗涤,加二抗后再孵育,洗涤,显色,摄片。三、统计分析所有数据以均数±标准差(X±SD)表示,采用SPSS 16.0及Excel统计软件进行数据处理,组间比较用单因素方差分析(ANOVA),在单因素方差分析有意义的基础上再进行组间两两比较,两变量之间相关关系行Spearman相关分析,P<0.05为差异显著。结果1、脑水含量测定大鼠实验性ICH后脑水含量均增高,6h开始升高,3d时达高峰,7d时逐渐降低,但是与对照组相比仍有显著差异(P<0.05)。2、脑组织EB含量测定大鼠实验性ICH后脑组织EB的含量增加,6h时即明显升高,3d时达到最高,7d组逐渐降低,但是与对照组相比仍有显著差异(P<0.05)。3、大鼠实验性ICH后EBA蛋白表达正常对照组大鼠皮质微血管内皮细胞膜EBA呈强阳性表达,假手术对照组和生理盐水对照组。脑出血后6h组在血肿周围和同侧皮质微血管内皮细胞膜EBA表达减少：脑出血后1d组EBA表达水平明显减少；脑出血3d组EBA表达显著减少；脑出血后7d组较3d组的EBA表达增加,但是仍低于6h和1d组。4、大鼠实验性ICH后微血管周围Fibrinogen蛋白表达正常对照组大鼠皮质微血管周围未见Fibrinogen表达,假手术对照组和生理盐水对照组Fibrinogen表达升高,但与正常组比较无显著差异。脑出血后6h在血肿周围大脑皮质有Fibrinogen弱阳性表达,阳性部位主要为微血管周围。1d组Fibrinogen表达水平明显增加。脑出血后3d达高峰,着色最深。7d后Fibrinogen表达水平逐渐降低,但较对照组仍有显著差异(P<0.05)。5、Western blot检测Fibrinogen蛋白表达正常对照组几乎未见Fibrinogen表达,假手术对照组和生理盐水对照组Fibrinogen表达与正常组比较无显著差异。脑出血后各组均可在34KD处见Fibrinogen蛋白表达条带。6h组有Fibrinogen弱阳性表达,1d和3d组Fibrinogen表达逐渐增加,3d达高峰,7d时Fibrinogen表达水平逐渐降低,但较对照组仍有显著差异(P<0.05)。讨论在本实验中采用向大鼠右侧尾状核内注射自体股动脉血制作脑出血模型,通过免疫组化法对EBA进行检测,发现出血后的大鼠脑组织中EBA的动态表达。另外,本实验对ICH后BBB的通透性分别采用外源性示踪剂(EB)和内源性示踪剂(Fibrinogen)两种方法进行了测量,进一步证实内源性示踪剂的准确性和可靠性。近年来,许多实验研究都证实,EBA参与了各种原因引发的脑水肿的发生和发展。本试验结果示,脑出血组与对照组相比,EBA的表达在6h开始减少,1d和3d组EBA表达水平逐渐减少,3d时EBA表达最少,以后表达逐渐恢复,7d组较前有恢复。而BBB通透性的变化规律与脑水含量的测定则与之相反,ICH后6h可见轻度升高,1d-3d逐渐升高,3d时达到高峰,之后逐渐下降,7d时仍高于正常水平。即BBB通透性和脑水肿的程度呈正相关,EBA的表达与BBB通透性和脑水肿的程度呈负相关。提示ICH后EBA在脑组织表达的减少、BBB通透性的开放均参与了脑水肿的形成。同时,BBB通透性与EBA的表达之间存在负性相关,提示EBA的表达减少可能通过影响BBB的通透性间接参与了脑水肿的形成。本文关于EBA在ICH后脑水肿病理生理机制的探讨结果,一方面完善ICH后脑水肿的发生和发展的可能机制,另一方面为临床探索有效治疗ICH的方法提供了一定的理论基础。结论1、本实验结果提示在大鼠脑出血后EBA在脑组织表达减少。2、EBA可能通过影响BBB的通透性,参与脑出血后脑水肿的发生。