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脂肪氧合酶(lipoxygenase, LOX)催化具有顺,顺-1,4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸的双加氧反应,如亚油酸、亚麻酸。反应过程中形成具有共轭双键的氢过氧化物,这些氢过氧化物性质活泼,是重要的化学反应中间体,在食品、医药、化工等领域有着广泛的应用前景,尤其在食品加工中具有重要的应用价值,如面粉及其制品品质改良、制备风味化合物、茶叶加工等。然而脂肪氧合酶存在催化活性低、热稳定性差等缺点,限制了LOX酶制剂在食品加工中的应用。因此对脂肪氧合酶进行分子改造一直是国内外研究者关注的热点。本文对来源于Anabaena sp.PCC 7120脂肪氧合酶分子进行定向进化和定点突变研究,筛选得到高活力和热稳定性同时提高的突变酶,并对突变酶分离纯化及酶学性质研究。同时,通过对突变酶三维结构进行模拟分析,解析突变酶酶活及热稳定性提高的分子机制。主要研究结果分述如下。1.脂肪氧合酶高通量筛选体系的建立。采用化学渗透法、冻融法和酶解法破碎重组E. coli细胞,并采用单因素试验和L25(5‘)正交试验对细胞破碎条件进行优化,确定细胞破碎最佳条件为：溶菌酶添加量为1.5 mg/mL、溶菌酶处理时间40 min、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)添加量为2.0 mmol/L、吐温-60添加量为2%、冻融温度(-70℃冷冻37℃融解)、冻融次数3次；建立了基于酶标仪、96微孔板和环境温度集成的耐温-性提高突变体筛选方法,同时对96孔板高通量筛选模型进行了评估,计算“Z值”在0.5-1.0之间,说明模型可靠,可用于脂肪氧合酶活力的高通量筛选。2.利用易错PCR技术提高脂肪氧合酶的活力及热稳定性.探索了易错PCR反应的适宜Mg2+浓度、Mn2+浓度、dNTPs浓度和Taq DNA聚合酶浓度。最终选择Mg2+浓度为2mM,Mn2+浓度为0.1 mM, dNTPs浓度0.2mM,TaqDNA聚合酶浓度0.05 U/uL的条件进行脂肪氧合酶基因的易错PCR反应。利用建立的基于96微孔板高通量筛选模型,经过两轮易错PCR,从8000个转化子中筛选到4株突变体,50℃下的半衰期分别从8 min提高到11.9 min.14.6 min、13.3 min和11 min,突变体的测序结果表明,分别发生了T94A,V328A/E330G, N305D/L358I以及E126G/T171A/N305D氨基酸置换,分析脂肪氧合酶热稳定性提高的原因是由于疏水作用力的引入显著的帮助分子折叠,提高其热稳定性,以及氢键的形成使系统获得能量来增加稳定性。3.利用DNA Shuffling技术改造脂肪氧合酶分子.以易错PCR筛选得到的突变体作为亲本进行DNA Shuffling,从6000个克隆子中筛选到一株高酶活突变体D22,经IPTG诱导后其酶活力比野生酶提高了2.17倍,50℃下的半衰期提高到15.2 min,另外两个突变体D111和D2221的半衰期分别提高到16.6 min和18 min。采用SWISS-MODEL数据库模拟生成突变酶的三维结构,根据模拟的三维结构分析其位点的突变效应。结果表明,三个突变体N305D、D66N/L160P和Y184H/N305D,分别通过组氨酸带正电的侧链影响活性中心、稳定α-螺旋：降低去折叠熵、形成水化层；改变电荷性质或者电子云密度影响着脂肪氧合酶的催化活性和稳定性。同时,对突变体酶学性质进行研究发现,当温度达到50℃时,野生酶已丧失80%相对酶活力,突变体酶D22、D111和D2221还保留50%相对活力；最适反应温度从45℃分别提高到50℃、50℃和55℃；最适反应pH分别为10.0,9.0,9.0。此外通过圆二色谱测定蛋白的二级结构,结果表明突变体D22、D111和D2221 p-转角数和折叠数的增加,这有利于维持蛋白的稳定；以及对突变酶进行热变性温度分析,发现突变体D22、D111、D2221氢键和疏水作用力的引入使得热变性温度分别提高了1℃、1.2℃、2℃。4.脂肪氧合酶分子的定点突变研究。通过饱和定点突变验证了305位对脂肪氧合酶的酶活力及热稳定性的影响,发现305位天冬氨酸的替换起着至关重要的作用,保持305位α-螺旋稳定的氨基酸排序为Asp>Gln>Phe>Tyr>Arg>Lys>Cys>Asn。以饱和定点突变筛选的突变体N305W、N305C、N305R和N305D为模板,在160位和184位引入突变,突变体L160Y/N305D,Y184L/N305D,Y184L/N305C,Y184L/N305W, L160Y/N305R的热稳定进一步提高,在50℃下的半衰期达到30 min,并对突变酶的三维结构模拟分析,引入的精氨酸(Arg)、络氨酸(Tyr)、天冬氨酸(Asp)、亮氨酸(Leu)、色氨酸(Trp)和半光氨酸(Cys)通过增加带电残基数量,增加疏水氨基酸及转角数,增加氢键的数目,以及螺旋和折叠片的形成,来增强脂肪氧合酶的热稳定性。5.突变酶对面团流变特性的研究。将突变酶N305D和Y184L/N305D添加到面粉中,分别在30℃、40℃和50℃下测定面团的动态流变学特性。结果表明,突变酶N305D的弹性模量G’在30-40℃较大,突变酶Y184L/N305D的弹性模量G’较空白和野生酶相比增加了104%、108%,并在40-50℃之间弹性模量G’稳定在60000 Pa之上；突变酶N305D的黏性模量G”较空白组和野生酶(WT)相比分别提高了16.84%、8.53%；突变酶Y184L/N305D的黏性模量G”较空白和野生酶相比增加了91.8%、78.2%,说明面团在突变酶N305D和Y184L/N305D作用下恢复其原始形状的能力和抵抗流动的性能增强。