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奶牛乳腺炎是奶牛乳腺组织发生的一种炎症，其发病率高，危害性大，已成为影响世界奶牛业发展最主要的疾病之一。利用同位素标记的相对和绝对定量方法（isobaric tags forrelative and absolute quantitation, iTRAQ）筛选出α2-巨球蛋白（alpha-2-macroglobulin, A2M）基因，发现其在患乳腺炎乳腺中的表达量是健康乳腺的3.5倍。A2M是一种广谱蛋白酶抑制剂，通过抑制侵入机体病原体释放的多种蛋白酶与毒素,减少其对宿主的破坏，增强宿主的抗病力。借助分子生物学手段，对此基因进行功能性分子标记筛选和转录调控分子机制研究，对于奶牛乳腺炎抗性分子育种有重要的意义。1. A2M基因定量、可变剪切体及功能SNPs的鉴定为初步探索A2M基因在奶牛乳腺炎中的作用，利用RT-qPCR测定了A2M基因mRNA在乳腺组织中的表达，发现患病乳腺组织的表达量显著高于健康组织（p<0.05）。Pre-mRNA选择性剪切可以改变基因编码区序列，产生多种蛋白质，改变基因的功能。利用RT-PCR发现了A2M基因24种新的可变剪切体，测序发现2个处于外显子剪接增强子（ESE）内的功能性单核苷酸突变（SNP），c.3535A>T和c.4520T>C。其中c.3535A>T突变增加了SC35（SRSF2）、SRp40（SRSF5）两种剪切蛋白的结合位点，可能参与剪切体A2M-AS4的剪切过程；而c.4520T>C突变增加了SRp40剪切蛋白的结合，可能参与剪切体A2M-AS24的剪切过程。2. A2M基因3’UTR和bta-miRNA-2898相关性研究成熟miRNAs可与靶基因mRNA的3端非翻译区（3’UTR）特异序列结合，引起mRNA翻译抑制或降解，从而在转录后水平调节靶基因的表达过程。通过RNAHYBRID和RNA22软件预测发现bta-miR-2898可以结合A2M基因3’UTR，且在结合靶序列内发现一个SNP （c.46594661delC），对此SNP进行基因分型发现突变型（//）具有较低的体细胞评分（SCS）（P<0.05）。将野生型（CC）和突变型（//）的3’UTR分别连接到PMIR-ReportTMLuciferase报告载体中，和miR-2898表达载体共转染293T细胞。通过双荧光素报告系统分析，发现miR-2898可通过和A2M基因3’UTR结合降低报告基因的表达，同时c.46594661delC突变影响了其和靶序列的结合能力。这些数据表明miR-2898可能通过和A2M基因3’UTR结合，影响其表达，参与对奶牛乳腺炎的免疫调节过程；3’UTR的突变型（//）可用于奶牛乳腺炎抗性育种的功能性分子标记。3. A2M基因核心启动子及功能SNPs的鉴定启动子是基因重要的组成部分，可以控制基因转录的起始时间和表达的程度。5端侧翼区的SNPs可以影响启动子区的活性，改变基因的表达。目前还没有关于奶牛A2M基因启动子区及其相应特征的报道。首先利用生物信息学方法预测基因的启动子区，然后将不同长度的启动子片段构建入pGL3-Basic荧光素报告载体，瞬时转染293T细胞，鉴定了5端侧翼区g.-2641～g.-2479位点为A2M基因核心启动子区。对此区域进行了生物信息学分析，发现存在AP-1, E2F和TATA盒等转录因子结合位点，这些转录因子可能在A2M基因转录过程中起了一定的正向或负向调控作用。测序发现A2M基因5端侧翼区存在4个SNPs （g.-724A>G, g.-665G>A, g.-535C>G, g.-520-519insA），将含有突变型（AAGGCC//）和野生型（GGAAGGAA）的启动子片段分别构建入荧光素报告载体，转染细胞后发现突变型的启动子活性显著高于野生型（P<0.05）。软件分析发现g.-724A>G突变增加了NKx-2.5转录因子结合位点，g.-520-519insA增加了C/EBPb结合位点。本实验同时把调控区所发现的5个SNPs进行了单倍型组合，并将其和SCS进行关联分析，发现单倍型组合H1H2, H1H3和H2H4（H1:AGC//，H2:AGC/C，H3: GAGA/，H4: GAGAC）具有较低的SCS。