颉颃放线菌XA-1菌株的筛选、鉴定及其发酵条件研究

来源 :沈阳农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:cshuangyong
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本文针对植物真菌病害分离筛选出一株颉颃放线菌XA-1。从菌种的筛选、鉴定、繁殖培养基的筛选及摇瓶发酵条件等方面进行了系统研究,结果如下:1.通过广泛筛选获得了生防放线菌菌株XA-1。 采用稀释分离法,以高氏一号培养基为分离培养基,从辽宁地区不同土壤中分离获得放线菌120株;以番茄叶霉病菌(Fulviafulva)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichumcapsici)、葡萄白腐病菌(Coniothyriumdiplodiella)、烟草赤星病菌(Alternariaalternata)、小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)等25种植物病原真菌为供试菌,采用活体平板测定法,共获得对上述病原真菌具有颉颃作用的放线菌9株;采用杯碟法测定筛选出的9个菌株发酵液的抑菌活性,从中筛选出抑菌作用较理想的放线菌1株,编号为XA-1;对该目的生防菌株的抗菌谱进行研究,采用菌株活体(抑菌圈法、菌落生长法)和发酵液(杯碟法、生长速率法)分别测定其对上述病原真菌的抑菌效果。测定结果表明:颉颃菌株XA-1无论其活体还是其发酵液,对供试的25种病原真菌均有不同程度的抑菌活性。 通过对XA-1菌株作用机理初步研究结果表明:菌株活性产物能强烈抑制病原菌菌丝的生长和孢子的萌发。混有发酵液培养基上病原菌菌丝生长缓慢,菌落隆起形似伞状,菌丝短粗,出现不规则膨大,孢子芽管的伸长明显受到抑制。 2.利用传统分类和分子分类相结合的方法明确了菌株XA-1的分类地位。通过对XA-1菌株的形态特征、培养特征、生理生化特性等方面的试验观察,结合16SrRNA基因序列的测定,与Genebank序列数据库中的相关菌株序列进行比较,菌株XA-1与Saccharothrixtangerinus同源性达到99.65%,系统发育树分类比较也表明其与Saccharothrixtangerinus的亲缘关系最近。鉴定结果认为,放线菌菌株XA-1的分类地位归属于橘色糖丝菌Saccharothrixtangerinus。该菌株为稀有放线菌,国内未见报道。 3.对颉颃放线菌菌株XA-1进行了菌种繁殖培养基的筛选。研究表明,菌株XA-1菌种繁殖的最佳培养基为黄豆饼粉浸液琼脂固体培养基。在此培养基上,菌丝生长密度大、产孢速度快、生长周期短;在连续传代培养5代过程中均比较稳定,未出现衰退现象;发酵液中的抗菌物质均有较强的抑菌作用。该研究结果为菌株XA-1的深入研究和开发奠定了良好的基础。 4.筛选出适合菌株XA-1产生抗生素的发酵培养基,并对其摇瓶发酵条件进行了初步研究。 通过单营养因子试验和均匀设计试验,优化了菌株发酵培养基的组成,同时测定了培养时间、菌龄、接种量、摇床温度及转速、初始pH、摇瓶装液量等对菌株产生抗生素的影响。 研究结果表明:菌株XA-1对碳源的利用能力,依次为马铃薯淀粉>葡萄糖>乳糖>麦芽糖>可溶性淀粉>蔗糖,其中马铃薯淀粉作为碳源时抑菌圈直径最大,而且其在实际生产中容易获得,成本低廉,因此应用中可选用马铃薯淀粉作为碳源;菌株对氮源的利用,以黄豆粉、黄豆饼粉和蛋白胨为最优,其它依次为花生饼粉、(NH4)2SO4、酵母粉;对各种营养成分用量的单因素试验表明,马铃薯淀粉3%~5%、黄豆饼粉2%~4%、蛋白胨0.2%~0.4%、NaCl0.2%~0.4%、CaCO30.1%~0.2%,是产生抗生素的适宜范围。根据均匀试验的结果得到了优化的发酵培养基配方组成:3.90%马铃薯淀粉、2.65%黄豆饼粉、0.20%蛋白胨、0.20%NaCl、0.10%CaCO3。配方实测抑菌圈直径为43.15mm。研究结果还表明,菌株XA-1的最佳发酵条件为26℃,120r/min,培养基初始pH为4.5,摇瓶装液量90mL/250mL,最佳发酵时间约为88h。培养96h的种子液以l0%的接种量转接于摇瓶发酵可获得较大的抗生素产量。
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