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草鱼(Ctenophaiyngodon idellus)又称白鲩、草根鱼、厚鱼,有生长快速、产量高和养殖成本低的特点,是中国重要的淡水养殖品种。2011年中国草鱼总产量达到454万吨,居世界首位(FAO,2012),具有极好的经济价值。草鱼已经被东亚,北美和欧洲超过100个国家引进。目前在中国和世界其他地区,草鱼在养殖过程中面临病害频发和药物滥用问题,特别是高温下,鱼类病害进一步加剧。这不利于草鱼养殖产业的可持续发展。本论文针对养殖过程中的高温胁迫因子,以草鱼肝细胞为研究对象,开展不同温度应激及其恢复对草鱼肝脏细胞氧化损伤和热应激蛋白表达影响研究,探索大黄素和恩诺沙星对草鱼肝脏细胞毒性、氧化损伤、凋亡和热应激蛋白(HSP60、70和90)相对mRNA表达的影响。分析了高温预处理和低浓度大黄素对草鱼肝细胞抗高温应激的保护作用,为探讨大黄素的应激调控机理提供依据。1.不同高温应激和恢复对草鱼肝细胞活力、氧化损伤和热应激蛋白表达的影响本试验是为了研究不同高温应激和恢复对草鱼肝细胞活力、乳酸脱氢酶(LDH)释放、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)产物、总抗氧化能力(T-AOC)、热应激蛋白(HSP60、70和90)相对mRNA表达的影响。首先将培养的草鱼肝细胞分别在高温30℃、32℃和34℃条件下暴露0.5 h,然后将各组细胞立即放回27℃恢复6h、12h、24 h和48 h。结果表明高温显著降低细胞活力,增加了LDH释放。恢复后细胞损伤减少。高温应激增加了MDA水平,降低了抗氧化能力(降低了细胞的SOD活性和T-AOC).然而,氧化损伤随着恢复时间增加而下降,MDA、SOD活性和T-AOC有所恢复。当细胞暴露于32℃,HSP60 mRNA的表达在恢复6 h和24 h高于对照组(P<0.05),HSP70 mRNA的表达在恢复6 h、24 h和48 h高于对照组(P<0.05),HSP90 mRNA的表达在恢复6 h和24 h高于对照组(P<0.05)。恢复过程中,HSPs基因表达的变化反映了细胞从生长状态过渡到细胞修复状态。总之,高温抑制细胞活力,引起氧化损伤,并增加HSPs表达,而HSPs在草鱼肝细胞的热应激中有重要作用。2.高温应激不同时间对草鱼肝细胞活力、氧化损伤和热应激蛋白表达的影响本试验的研究目的是探讨高温应激不同时间对草鱼肝细胞活力、LDH释放、SOD活性、MDA产物、T-AOC和HSPs(HSP60.70和90)相对mRNA表达的影响。把培养的细胞在高温(32℃)下分别暴露0.5、1、2、4、8 h。结果表明,高温应激显著降低细胞活力(P<0.01),增加0.5 h和1 h处理组的LDH释放(P<0.05)。此外,0.5和8 h高温处理组的T-AOC明显降低(P<0.05),1 h高温处理组的SOD活性明显降低(P<0.05),8 h处理纽MDA产物显著增加(P<0.05),表明高温引起氧化应激。这可能一定程度解释了此时细胞活力的减少和LDH释放的增加。SOD活性、MDA产物和T-AOC在高温应激2 h和对照组之间的差距最小。这表明,细胞能诱导抗氧化酶系统对抗氧化应激。进一步的试验表明,HSP60 mRNA在应激1、2和4 h(P<0.05),HSP70 mRNA在应激0.5和1 h(P<0.01),和HSP90 mRNA在所有应激时间点的mRNA表达都显著增加(P<0.01)。这表明HSPs有能力调节细胞抗应激反应,对保护生物热应激有重要作用。总之,高温抑制草鱼肝细胞增殖,诱导细胞氧化应激,提高HSPs表达。3.大黄素和恩诺沙星对草鱼肝细胞活力、抗氧化能力、凋亡和热应激蛋白表达的影响本试验是为了探讨不同浓度大黄素和恩诺沙星对草鱼肝细胞活力、LDH释放、SOD活性、谷胱甘肽(GSH)、T-AOC、MDA产物、活性氧(ROS)、细胞膜电位(△Ψm)、凋亡和HSPs (HSP60、70和90)相对mRNA表达的影响。把培养的细胞用不同浓度大黄素(0.04-25μg·ml-1)和恩诺沙星(12.5-20μg·mL-1)处理24 h。结果表明,大黄素(1-25 μg·mL-1)增加LDH释放(P<0.05),其诱导的细胞凋亡伴随着△Ψm的下降和ROS的升高；大黄素处理组SOD活性和T-AOC显著降低表明大黄素诱导氧化应激导致失去其清除自由基的酶的活性,而GSH的升高表明细胞尝试去维持氧化还原平衡,但是不足以补偿大黄素诱导的氧化应激。同时大黄素诱导HSP60、70和90mRNA表达上升,说明大黄素可以产生保护作用。而用恩诺沙星处理细胞表明,恩诺沙星(50-200 μg·mL-1)也显著降低细胞活力增加LDH释放(P<0.05),诱导细胞凋亡和膜电位下降(P<0.05),恩诺沙星显著升高ROS和MDA产物,降低T-AOC (P<0.05)表明恩诺沙星引发脂质过氧化作用,破坏氧化平衡。HSP60和HSP70 mRNA在低浓度的恩诺沙星作用下先升高,后下降,而HSP90mRNA的表达持续下降说明高浓度恩诺沙星导致细胞的病理性损伤或蛋白合成受到抑制。4.不同高温预处理对大黄素处理草鱼肝细胞的影响本试验是为了研究不同高温预处理对大黄素处理的草鱼肝细胞活力、LDH释放、SOD活性、T.AOC.ROS.△ψm和HSPs(HSP60.70和90)相对mRNA表达的影响。把培养的细胞在高温30℃、32℃和34℃暴露0.5 h,然后立即放回27℃恢复12 h,接着把细胞用不同浓度大黄素(0.04-25μg·mL-1)处理24 h。试验结果显示,30℃预处理组显著增加高浓度大黄素组((1.5.25μg·mL-1细胞活力(P<0.05),降低LDH释放(P<0.05),提高细胞膜电位(P<0.05),说明30℃高温预处理可以减轻大黄素对细胞产生的损伤；30℃高温预处理组的ROS最低,和大黄素对照组之间差异显著(P<0.05),这表明草鱼肝细胞在大黄素处理后,机体正在经历氧化应激诱导的损伤,细胞有可能引起生理功能紊乱甚至丧失；30℃高温预处理组SOD活性和T-AOC显著增加(P<0.05),说明30℃温和高温预处理使细胞产生抗氧化酶而保护其不受ROS的损伤；3种高温预处理(30℃、32℃和34℃)都能显著增加HSPs的表达(P<0.05),由此推断出高温预处理使得草鱼肝细胞预先诱导产生的HSPs会保护氧自由基,抑制细胞凋亡,对高浓度大黄素产生的细胞损伤产生保护作用。5.不同浓度大黄素对高温应激草鱼肝细胞的影响本试验是为了研究不同浓度大黄素对高温应激草鱼肝细胞活力、LDH释放、SOD活性、T-AOC、ROS、△ψm和HSPs(HSP60.70和90)相对mRNA表达的影响。把培养的细胞用不同浓度大黄素处理(0.04-1μg·mL-1)处理24 h,然后让细胞在高温32℃应激0.5 h。结果发现0.04μg.mL-1大黄素浓度组细胞活力显著高于高温应激组(P<0.05),LDH释放显著低于高温应激组(P<0.05),说明0.04μg·mL-1大黄素对高温应激细胞有保护作用。而其他大黄素处理组和高温应激组差异不显著,说明大黄素的保护作用并没有剂量效应,0.04μg·mL-1大黄素浓度组SOD活性高于高温应激组(P<0.05),ROS含量低于高温应激组,说明大黄素可有效地提高细胞SOD抗氧化酶的活性,提高抗氧化能力,在一定程度上抑制了高温对草鱼肝细胞的氧化损伤。0.04μg·mL-1大黄素浓度组能显著增加HSP90 mRNA的表达(P<0.05),由此推断出0.04μg·mL-1大黄素使得草鱼肝细胞诱导产生的HSP90会保护氧自由基,抑制细胞凋亡,对高温应激产生保护作用。