[研究背景]如何快速、高效、优质的修复软组织缺损,一直是整形外科领域的研究热点。传统软组织缺损修复方法可概括为“彻底清创-敷料覆盖-组织移植”,但这种方法对于组织缺损严重且合并细菌感染的病例修复效果并不理想。1993年,Fleischmann发现将创面密闭并保持负压状态有助于减少创面细菌负荷,加快愈合速度。他将这种通过“创面封闭-负压抽吸”方式促进创面愈合的物理治疗方法称之为负压创面技术(Negative Pressure Wound Therapy, NPWT).1995年,负压创面技术正式被美国食品和药品监督管理局(Food and Drug Administration, FDA)批准用于软组织缺损的临床治疗。20余年的研究表明,负压创面技术适用于外伤及周围血管疾病等多种原因造成的急慢性软组织缺损,具有提高创面愈合质量、缩短住院时间以及降低诊疗费用的特点。但是,研究人员也发现负压创面技术存在创面清洁效果差,长期使用可靠性下降,治疗方法单一等缺陷。有学者提出,创面灌注与负压创面技术相结合的创面灌注-负压技术(Negative Pressure Wound Therapy With Instillation, NPWTi)有助于弥补负压创面技术的不足,更好的促进创面愈合。与负压创面技术广泛应用于创面治疗的现状相比,创面灌注-负压技术的研究尚处于起步阶段。目前,创面灌注-负压技术推广应用的瓶颈主要体现在以下两个方面：第一,现有的创面灌注-负压治疗装置不便于临床应用；第二,创面灌注-负压技术缺乏相应理论指导。本课题拟在研发新型自控式创面主动灌注-负压治疗装置基础上,以猪软组织缺损模型为平台,探讨创面灌注-负压技术在创面清洁以及早期损伤组织病理生理转归等方面的作用,以期为快速、高效、优质修复软组织缺损提供装备支持和理论指引。[目的](1)研发自控式创面主动灌注-负压吸引治疗装置。(2)构建猪软组织缺损模型。(3)探索创面灌注-负压技术清除创面异物的效能。(4)探索早期应用创面灌注-负压技术对创面组织血管生成的影响。(5)探索早期应用创面灌注-负压技术对创面组织炎症水平的影响。(6)探索早期应用创面灌注-负压技术对创面组织胶原沉积的影响。[方法](1)借助现代微电子技术、单片机控制技术和传感器技术,研发新型自控式创面主动灌注-负压治疗装置。自控式创面主动灌注-负压治疗装置主机由中控模块、负压模块、灌注模块、显示模块、警报模块和动力模块组成；采取文献学习及实物测试的方式完成装置组件的选择和功能流程的规划。(2)使用”皮肤切除-重物撞击”的方法制备猪软组织缺损模型。6只巴马小型香猪左右臀部及肩胛部共24处创面,根据软组织缺损部位分为4组,分别是左肩胛组、左臀部组、右肩胛组和右臀部组,通过数码摄像结合软件测量的方法计算创面面积；通过液体滴定的方法测量创面体积；通过苏木精-伊红染色法(Hematoxylin Eosin,HE)的方法测定创面巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞数量；通过免疫组织化学法(Immunohistochemistry, IHC)标记组织Caspase-3蛋白表达位置；免疫印迹法(Western Blot, Western-Blot)检测组织Caspase-3蛋白表达水平；通过反转录RCR法(Reverse Transcription PCR, RT-PCR)检测组织Caspase-3 mRNA水平；采用随机区组设计资料方差分析的统计方法对实验数据进行分析；探索“皮肤切除-重物撞击”法制备猪软组织缺损模型不同部位损伤程度的一致性。(3)使用“皮肤切除-重物撞击-石墨涂布”的方法制备猪污染创面模型。6只巴马小型香猪左右臀部及肩胛部共24处创面,根据创面清洁方法将其随机分为3组,分别是纱布敷料组(Gauze组)、NPWT组和NPWTi组。Gauze组使用纱布敷料覆盖创面的方法清洁创面,NPWT组使用新型自控式创面主动灌注-负压治疗装置的创面负压模式(压力-125mmHg,负压时间4min,间歇6min)清洁创面,NPWTi组使用自控式创面主动灌注-负压治疗装置的创面主动灌注-负压模式(压力-125mmHg,负压时间4min,灌注时间lmin,浸润时间5min,灌注量5ml/次)清洁创面；通过Quality One软件检测治疗前、治疗后1h、2h和3h创面灰度情况；使用协方差分析的统计方法对实验数据进行分析；比较纱布覆盖治疗、负压创面治疗和创面灌注-负压治疗清洁创面的效能。(4)采用“皮肤切除-重物撞击”的方法制作猪软组织缺损模型。6只巴马小型香猪左右臀部及肩胛部共24处创面,根据治疗方法将其随机分为3组,分别是Gauze组、NPWT组和NPWTi组。Gauze组使用纱布敷料覆盖创面的方法治疗,NPWT组使用新型自控式创面主动灌注-负压治疗装置的创面负压模式(压力-125mmHg,负压时间4min,间歇6min)治疗,NPWTi组使用新型自控式创面主动灌注-负压治疗装置的创面主动灌注-负压模式(压力-125mmHg,负压时间120min,灌注时间1min,浸润时间9min,灌注量5m1/次)治疗。治疗前、治疗后1d、3d、5d和7d获取组织样本,通过IHC法标记组织血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)和低氧诱导因子1-a (Hypoxia Inducible Factor 1-a, HIF1-a)蛋白表达位置；Western-Blot法检测组织HIF1-α和VEGF蛋白表达水平；RT-PCR(反转录PCR法)法检测HIF1-α mRNA和VEGF mRNA表达；使用协方差分析的统计方法对实验数据进行分析；探索纱布覆盖治疗、负压创面治疗和创面灌注-负压治疗对创面血管增生的影响。(5)采用“皮肤切除-重物撞击”的方法制作猪软组织缺损模型。6只巴马小型香猪左右臀部及肩胛部共24处创面,根据治疗方法将其随机分为3组,分别是Gauze组、NPWT组和NPWTi组。Gauze组使用纱布敷料覆盖创面的方法治疗,NPWT组使用自控式创面主动灌注.负压治疗装置的创面负压模式(压力-125mmHg,,负压时间4min,间歇6min)治疗,NPWTi组使用自控式创面主动灌注-负压治疗装置的创面主动灌注-负压模式(压力-125mmHg,负压时间120min,灌注时间1min,浸润时间9min,灌注量5m1/次)治疗。于治疗前、治疗后1d、3d、5d和7d获取组织样本,通过HE法计算组织中巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数量；IHC法标记组织肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-a, TNF-a)和白细胞介素-6(Interleukin-6, IL-6)蛋白表达位置；Western-Blot法检测组织TNF-a和IL-6蛋白表达水平；RT-PCR(反转录PCR法)法检测TNF-a mRNA和IL-6 mRNA水平；使用协方差分析的统计方法对实验数据进行分析；探索纱布覆盖治疗、负压创面治疗和创面灌注-负压治疗对创面炎症水平的影响。(6)采用“皮肤切除-重物撞击”的方法制作猪软组织缺损模型。6只巴马小型香猪左右臀部及肩胛部共24处创面,根据治疗方法将其随机分为3组,分别是Gauze组、NPWT组和NPWTi组。Gauze组使用纱布敷料覆盖创面的方法治疗,NPWT组使用自控式创面主动灌注-负压治疗装置的创面负压模式(压力-125mmHg,负压时间4min,间歇时间6min)治疗,NPWTi组使用自控式创面主动灌注-负压治疗装置的创面主动灌注-负压模式(压力-125mmHg,负压时间120min,灌注时间lmin,浸润时间9min,灌注量5m1/次)治疗。于治疗前、治疗后1d、3d、5d和7d获取组织样本,通过苦味酸-酸性复红染色法(Van Gieson, VG)标记组织胶原蛋白位置；分光光度法检测组织羟脯氨酸(Hydroxyproline, Hyp)含量；Western-Blot法检测组织Ⅰ型胶原蛋白(Collagen Ⅰ)和Ⅲ型胶原蛋白(Collagen Ⅲ)表达水平；RT-PCR(反转录PCR法)法检测Collagen Ⅰ mRNA和Collagen Ⅲ mRNA水平；使用协方差分析的统计方法对实验数据进行分析；探索纱布覆盖治疗、负压创面治疗和创面灌注-负压治疗对创面胶原沉积增生的影响。[结果](1)研制新型自控式创面主动灌注-负压治疗装置,该装置可实现负压创面治疗、灌注-负压治疗和创面脉冲冲洗等多种治疗功能。(2)使用”皮肤切除-重物撞击”的方法制备猪软组织缺损模型,左右肩胛部及臀部组织缺损面积、体积及组织巨噬细胞、中性粒细胞及淋巴细胞数量、Caspase-3蛋白及Caspase-3 mRNA水平差异无统计学意义(P>0.05)。(3)比较纱布覆盖治疗、负压创面治疗和创面灌注-负压治疗清洁创面效能的实验结果显示,Gauze组、NPWT组和NPWTi组不同时间创面灰度变化趋势有差异,治疗后1h、2h和3h创面灰度均以Gauze组为最高(P<0.05),NPWT组次之,NPWTi组最低(P<0.05)。(4)比较纱布覆盖治疗、负压创面治疗和创面灌注-负压治疗影响早期创面组织血管生成的研究显示,组织中可见VEGF和HIF1-α阳性表达,Gauze组、NPWT组和NPWTi组不同时间VEGF和HIF蛋白及VEGF mRNA和HIF mRNA表达趋势有差异,治疗后1d、3d、5d和7d组织VEGF和HIF1-α蛋白及VEGF mRNA和HIF1-α mRNA表达水平均以NPWTi组最高,NPWT组次之,Gauze组最低(P<0.05)(5)比较纱布覆盖治疗、负压创面治疗和创面灌注-负压治疗影响早期创面组织炎症水平的研究显示,组织中可见TNF-a和IL-6阳性表达,Gauze组.NPWT组和NPWTi组不同时间创面细菌负荷、巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数量,TNF-a和IL-6蛋白及TNF-a mRNA和IL-6 mRNA表达趋势有差异,治疗后1d、3d、5d和7d组织创面细菌负荷、巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数量,TNF-a和IL-6蛋白及TNF-αmRNA和IL-6 mRNA表达水平均以Gauze组最高,NPWT组次之,NPWTi组最低(P<0.05)。(6)比较纱布覆盖治疗、负压创面治疗和创面灌注-负压治疗影响早期创面组织胶原沉积的研究显示,组织中可见胶原蛋白阳性表达,Gauze组、NPWT组和NPWTi组不同时间Hyp含量、Collagen I和Collagen III蛋白及Collagen I mRNA和Collagen III mRNA表达趋势有差异,治疗后1d、3d、5d和7d组织Hyp含量、Collagen I和Collagen III蛋白及Collagen I mRNA和Collagen III mRNA表达水平均以NPWTi组最高,NPWT组次之,Gauze组最低(P<0.05)。[结论](1)相比纱布敷料覆盖和负压创面治疗而言,创面灌注-负压技术清洁创面的效能更高。(2)相比纱布敷料覆盖和负压创面治疗而言,创面灌注-负压技术更有利于促进组织血管增生。(3)相比纱布敷料覆盖和负压创面治疗而言,创面灌注-负压技术更有利于减轻组织炎症水平。(4)相比纱布敷料覆盖和负压创面治疗而言,创面灌注-负压技术更有利于加速组织中胶原沉积。