本文的研究主旨是鉴定并开发有益农用微生物资源,并对相关功能基因进行克隆和功能验证研究；本文的研究内容主要包括两部分：第一部分是苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)营养期杀虫蛋白基因(Vegetative insecticidal protein, Vip)资源的鉴定及功能验证,这是分子育种的上游工作,即发掘新的高效的杀虫基因资源,为农作物抗虫育种提供新的高效的基因资源；第二部分是大豆慢生根瘤菌属新种的鉴定研究。苏云金芽胞杆菌是目前研究最深入、历史最悠久、使用最广泛的生物防治微生物。为了提高生防制剂的杀虫活性、扩大杀虫谱和解决害虫的抗性问题,开发新的、高效杀虫蛋白的基因资源是解决这些问题的有效途径,这对我国的生物防治领域的发展有着重要的意义。Vip作为第二代生物杀虫剂,其与ICPs蛋白的氨基酸序列无同源性,两者的杀虫机理完全不同；Vip对某些害虫的杀虫活性比ICPs的杀虫活性还高,还对ICPs不能杀死的昆虫具有较好的活性。因此,分析不同生态环境下vip,基因资源分布情况,并开发新的、高效的vip基因是解决长期主要使用ICPs所带来的抗性问题的有效途径。根据以上研究背景,这部分的研究主要包括以下三个方面：第一,四川地区苏云金芽胞杆菌vip基因资源的评价。从四川盆地不同生态环境的14个地区采集的1789个土样中分离了2134个Bt菌株,因此证明了四川地区蕴藏着丰富的Bt菌株,且不同生态环境的Bt分布不同。本研究使用vipls-vipla, vip2s-vip2a和vip3s-vip3a引物对分别鉴定了2134个Bt菌株vip1、vip2和vip3基因资源情况,其中有8.6%和14.6%的Bt菌株分别含有vip1和vip2基因,67.4%的Bt菌株含有vip3基因。与vp1和vip2基因资源分布相比,四川地区vp3基因资源相对较为丰富。由于巴郎山和峨嵋山独特的生态环境,例如：高海拔、低温、氧压低、积雪覆盖,这两个地方的Bt菌株不含有vip1和vip2基因,且只有9.2%和8.4%的Bt菌株含有vip3基因。Vip1和Vip2是二元毒素,但是有些地方的Bt菌株只含有其中之一,例如：白马寺和梁山。不产生任何阳性PCR产物的Bt菌株可能不含有vip基因或者含有vip突变基因。尤其是能够产生Vip3的阳性蛋白带的22个Bt菌株,其很有可能含有新的的vip基因。第二,挖掘新的、高效的Vip,及生物活性功能验证。本研究采用PCR-RFLP鉴定的新的vip1基因,开发出了新的的二元毒素基因viplAcl/vip2Ae3;并建立了一个仅使用限制性内切酶AciI的PCR-RFLP鉴定体系,该方法简单、快速、有效。二元毒素基因viplAcl和vip2Ae3基因共表达于载体pCOLADuet-1,共表达蛋白Vip1Ac1/Vip2Ae3对同翅目害虫棉蚜(Aphis gossypii)有较好的杀虫活性,其致死中浓度LC50为87.5(34.2-145.3)ng mL-1。本研究建立的鉴定体系为挖掘更多新的、高效的Vip蛋白有着重要的意义；本研究挖掘的新的的Vip1Ac1-Vip2Ae3二元毒素为Vip资源库提供了新的资源,对于害虫的生物防治和昆虫的抗药性有着重要的意义。第三,构建多价效工程菌株,提高其杀虫活性、扩大杀虫谱和解决昆虫的抗性问题。Vip3主要对鳞翅目害虫有毒杀活性,Cyt2主要对蚊子幼虫有杀虫活性,并具有溶细胞和溶血作用,且对一些Cry蛋白具有协同增效作用。本研究将cyl2Aa3与vip3Aa29基因表达于pCOLADuet-1载体上,并分析了Cyt2Aa3和Vip3Aa29蛋白的协同作用。Vip3Aa29和Cyt2Aa3的共表达蛋白对同翅目害虫倦库蚊和稻瘿蚊的LC50分别为1.10μg mL-1and39μg mL-1,且对倦库蚊的毒杀活性存在较小的抑制作用。Vip3Aa29和Cyt2Aa3的共表达蛋白对水稻二化螟和甜菜夜蛾的LC5o分别为50.2μg mL-1和59.0μgmL-1,且存在协同增效作用。Vip3Aa29和Cyt2Aa3共表达蛋白对棉铃虫有明显的抑制作用,其抑制中浓度IC50为162.5μg mL-1,且SF接近于1,因此Vip3Aa29和Cyt2Aa3蛋白对棉铃虫不存在协同作用。本研究首次发现Vip3Aa29与Cyt2Aa3之间存在协同作用,为Vip3杀虫蛋白活性的提高提供了理论依据。在大豆根瘤菌资源分析方面,随着分类方法的不断发展,根瘤菌新种群越来越多地被发现,从而完善了根瘤菌的种群分类系统。本研究通过对16个大豆根瘤菌与慢生根瘤菌属所有种标准菌株的16S rRNA、结瘤基因nodC、固氮基因nifH以及六个持家基因(atpD、glnll、recA、gyrB、rpoB、dnaK)构建了系统发育树,结果发现这16个根瘤菌在系统发育树上处于一个独立的分支上面,是慢生根瘤菌属的一个新种。然后,从这个新种群的三个亚群中分别选择了009、085和099三个菌株进行DNA-DNA杂交,其gDNA与其他种的gDNA同源性明显小于70%,这进一步证明了这个种群是慢生根瘤菌的新种；这三个菌株的G+C含量是62-64%。最后,将这个新种命名为渥太华慢生根瘤菌(Bradyrhizobium ottawense),并将099菌株作为标准菌株保存于HAMBI,其保藏号为HAMBI3284,其表型特征描述如下：B. ottawense sp. gov.为革兰氏阴性菌株,菌株大小为0.4-0.9μm×1.7-2.3μm,形状为杆状,带有极生或亚极生鞭毛：最适生长温度为28℃,最适生长盐分是1%NaCl,最适生长pH是7.2；在YEM平板培养基上,28℃条件下培养7天,单菌落为白色、圆形且光滑,大小都是小于1mm,其世代生长时间为10.7-12.3h,且能产碱；对卡拉霉素(100(100μg/mL)、四环素(20μg/mL)、氯霉素(100μg/mL)、头孢霉素(<5μg/mL)盘尼西林(<10μg/mL)和红霉素(100μg/mL)六种抗生素具有抗性；能利用D-甘露糖、L-树胶醛糖做为碳源,对麦芽糖和L-鼠李糖的利用是微弱的；能将苏氨酸作为氮源来利用,且对L-脯氨酸和L-谷氨酸的利用是十分微弱的；其能与豆科植物Glycine max, Glycine soja, Macroptilium atropurpurem, Vigna unguiculata, Phaseolus vulgaris, Desmodium canadense, Amphicarpa bracteata共生结瘤,且大部分根瘤的固氮效率较高,但与Amphicarpa bracteata和Phaseolus vulgaris的共生结瘤而不能有效地固氮。