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背景和目的:多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma,MM)是一种在骨髓中浆细胞异常增生的恶性疾病,在恶性血液病中骨髓瘤的发病率居于第2位。目前MM尚无根治办法,虽然近十年来一大批新药如硼替佐咪,沙利度胺,来那度胺等在MM临床一线治疗的应用使患者预后显著改善,但是疾病的复发和耐药仍然是当前临床医师无法克服的问题。因此,此从分子水平探讨骨髓瘤发生发展,为从基因水平上防治该病具有重要的现实意义和理论价值。miRNA是一类在于原核和真核生物中广泛表达的长度为20-25 nt的非编码单链小RNA。mi RNA在转录后调控基因表达,通过与靶m RNA的3’UTR区结合引起靶基因的翻译抑制,在肿瘤的发生、发展及侵袭转移中发挥着癌基因或抑癌基因的功能。近几年研究发现mi RNA通过多种信号通路参与调节肿瘤的侵袭转移,调节细胞早期发育、细胞分化、调控基因表达以及转移瘤增殖等多个转移关键步骤。越来越多的证据表明,循环血浆或血清中的mi RNA可作为肿瘤的潜在的生物标志物,为肿瘤的诊断、检测预后情况及预测个体对药物治疗反应和抵抗情况以及为肿瘤的发生机制研究提供了方向。mi R-125b在肿瘤的发生和进展中起着重要的作用,然而mi R-125b在骨髓瘤中的作用还不清楚。mi R-125b在骨髓瘤中的功能和其分子机制需要深入地探索。多发性骨髓瘤患者血浆的mi RNA是否存在特异性的改变,是否与骨髓瘤的发生、发展密切相关?mi RNA通过什么样的分子机制调控骨髓瘤生长和侵袭转移?是否可以通过干扰mi RNA的调节达到初步治疗肿瘤的效果?鉴于此,本课题拟首先研究mi R-125b在骨髓瘤中的表达,然后观察调控mi R-125b表达对骨髓瘤细胞生长、侵袭和凋亡的影响。在这里,我们探索了PHLPP2和MKK7是否是mi R-125b的靶基因。并初步探讨mi R-125b影响细胞生长、侵袭和凋亡的分子机制。方法:高通量测序检测6例骨髓瘤血浆标本和6例健康对照组的血浆标本的mi RNA表达情况,并对差异表达基因进行初步功能分析。应用Real-time PCR的方法来进一步验证,并结合MM患者ISS分期、细胞遗传学、FISH检测等临床指标进行相关分析。应用Real-time PCR的方法来检测骨髓瘤血浆组织和骨髓瘤细胞株中mi R-125b和它的靶基因的表达水平。mi R-125b在骨髓瘤中的功能通过体外和体内实验来检测(CCK8实验、克隆形成实验、流式细胞术、transwell迁移和侵袭实验、免疫组化实验、免疫荧光实验、western blot实验以及裸鼠成瘤实验)。应用荧光素酶报告实验对mi R-125b的靶基因进行验证。结果:第一部分多发性骨髓瘤血浆mi RNA差异表达谱的建立通过高通量测序对骨髓瘤血浆样本进行分析,本研究一共筛选分析得到29个差异表达的mi RNA基因,其中有13个差异表达基因为上调mi RNA基因,16个基因为下调mi RNA基因。经过对骨髓瘤中表达上调的8个mi RNAs基因(mi R-125b,mi R-483-3p,mi R-4326,mi R-6894-3p,mi R-4498,mi R-490-3p,mi R-7155-5p和mi R-937-3p)进行q RT-PCR验证,5个mi RNA的表达水平(mi R-125b,mi R-4326,mi R-4498,mi R-490-3p和mi R-7155-5p)与芯片结果一致,证实了芯片数据的可靠性。骨髓瘤中mi R-125b在判断骨髓瘤方面具有较高的准确性,mi R-125b的表达水平与骨髓瘤的分期相关,而与病人的年龄,性别,核型没有相关性。第二部分体内外调控mi R-125b表达对骨髓瘤生物学功能的影响本研究应用实时荧光定量PCR检测了mi R-125b在骨髓瘤细胞系(MM1.S细胞,RPMI-8226细胞和U266细胞)和正常浆细胞中的表达情况。q RT-PCR研究显示mi R-125b在人骨髓瘤细胞株中的表达量显著高于人正常浆细胞的表达量,具有显著性差异(p<0.05),证明mi R-125b在骨髓瘤中作为癌基因型mi RNA存在。为了验证mi R-125b是否影响骨髓瘤细胞的生物学行为,本研究将合成的mi R-125b mimics和mi R-125b inhibitor转染入骨髓瘤细胞株(RPMI-8226细胞和U266细胞)观察细胞的增殖、侵袭和迁移能力。mi R-125b抑制物分别转染入骨髓瘤细胞株RPMI-8226和U266后细胞的增殖、侵袭和迁移能力明显降低,并且促进细胞的凋亡。上述实验结果已经证明mi R-125b促进了骨髓瘤细胞的增殖、侵袭与迁移力。最后体内实验证实降低mi R-125b的表达能够抑制裸鼠移植瘤的生长。第三部分:mi R-125b靶向PHLPP2调控Akt通路影响骨髓瘤的生物功能我们借助生物信息学方法(Target Scan,StarBase V2.0和mi RDB)预测mi R-125b能靶向结合PHLPP2的3’UTR区域,从而调节其表达。在本部分实验中,我们通过荧光素酶报告实验验证了mi R-125b直接靶向作用PHLPP2。为了进一步明确PHLPP2是mi R-125b的靶基因,q RT-PCR方法检测了mi R-125b对PHLPP2 m RNA水平的影响,RPMI-8226和U266细胞经mi R-125b抑制物作用后,PHLPP2 m RNA水平发生明显的上升。经mi R-125b mimic作用后,PHLPP2m RNA水平发生明显的下降。Westen blot实验同时证明,RPMI-8226和U266细胞经mi R-125b抑制物作用后,PHLPP2蛋白水平也发生明显的上升。经mi R-125b mimic作用后,PHLPP2 m RNA水平发生明显的下降。接下来,本研究还通过Real-time PCR法检测出PHLPP2在骨髓瘤中出现了显著的低表达,统计分析后发现mi R-125b与PHLPP2在骨髓瘤组织中表达呈现负相关。以上结果均证实了中mi R-125b调控的直接靶基因之一是PHLPP2。己有研究表明PHLPP2能使Akt去磷酸化而抑制Akt信号通路,我们推测mi R-125b引起的骨髓瘤是否通过靶向PHLPP2从而进一步激活Akt信号通路?为了解析这一点,我们应用western blot实验观察Akt通路相关蛋白表达。结果表明表明mi R-125b能促进Akt信号通路相关蛋白的活性。mi R-125b通过抑制PHLPP2表达继而调节Akt通路,从而在骨髓瘤细胞的增殖和转移过程中起促进作用。第四部分:mi R-125b靶向MKK7调控MAPK通路影响骨髓瘤的生物功能为进一步探究mi R-125b在骨髓瘤中发挥促癌作用的机制,我们借助生物信息学方法(Target Scan,Star Base V2.0和mi RDB)预测mi R-125b的另一个靶基因MKK7。我们通过荧光素酶报告实验验证了mi R-125b直接靶向作用MKK7。为了进一步明确MKK7是mi R-125b的靶基因,q RT-PCR方法检测了mi R-125b对MKK7 m RNA水平的影响,Westen blot实验检测MKK7蛋白水平的表达。以上结果均证实了中mi R-125b调控的直接靶基因之一是MKK7。我们推测mi R-125b是否通过靶向MKK7从而进一步调节MAPK信号通路引起的骨髓瘤的发生发展?为了解析这一点,我们应用western blot实验观察MAPK通路JNK相关蛋白表达。结果表明表明mi R-125b通过抑制MKK7表达继而调节MKK7/JNK通路,从而在骨髓瘤细胞的增殖和转移过程中起促进作用。