【摘 要】
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目的体外细胞实验研究TGF-β1诱导人胚肺成纤维分泌纤维化因子和LncRNA-ATB的改变,分析LncRNA-ATB与这些纤维化因子表达的相关性;建立矽肺体外细胞模型,分析LncRNA-ATB在矽肺
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目的体外细胞实验研究TGF-β1诱导人胚肺成纤维分泌纤维化因子和LncRNA-ATB的改变,分析LncRNA-ATB与这些纤维化因子表达的相关性;建立矽肺体外细胞模型,分析LncRNA-ATB在矽肺纤维化中的调控作用。方法1.体外培养人胚肺成纤维细胞(MRC-5),以浓度为0、2.5、5.0、10.0ng/m L的转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)刺激细胞24h。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)法测定LncRNA-ATB、Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)、Ⅲ型胶原蛋白(ColⅢ)、纤粘连蛋白(Fibronectin,FN)的mRNA相对表达水平,免疫印迹法(Western Blot)法检测ColⅠ、ColⅢ、FN蛋白表达水平,分析LncRNA-ATB与纤维化因子表达的相关性。2.体外培养MRC-5细胞,荧光原位杂交技术(FISH)确定LncRNA-ATB在细胞中的定位。脂质体转染针对LncRNA-ATB的si RNA进行RNA干扰,q RT-PCR法确定转染效果。MRC-5细胞随机分为三组,(1)ATB-si RNA组:转染LncRNA-ATB-si RNA;(2)NC-si RNA组:转染si RNA无义序列;(3)对照组:正常细胞培养。佛波酯(PMA)诱导人单核细胞THP-1分化成巨噬细胞。游离二氧化硅粉尘处理巨噬细胞,并与以上三组细胞共培养。24h后收集下室的MRC-5细胞,q RT-PCR和WB法检测FN、ColⅠ、ColⅢmRNA和蛋白质的相对表达量。结果1.随着TGF-β1刺激剂量的增加,细胞增殖活性增强,LncRNA-ATB、FN、ColⅠ和ColⅢ的mRNA在细胞中表达逐渐增加,与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。相关性分析结果显示,LncRNA-ATB的mRNA相对表达水平与FN(r=0.86)、ColⅠ(r=0.85)和ColⅢ(r=0.82)表达量呈正相关。经不同剂量的TGF-β1刺激后,FN、ColⅠ和ColⅢ蛋白的表达水平逐渐升高,不同剂量组与空白组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。2.荧光原位杂交检测发现,LncRNA-ATB在MRC-5的细胞核和细胞质中均有表达。转染ATB-si RNA的MRC-5细胞,LncRNA-ATB的表达降低,证明LncRNA-ATB细胞干扰模型成功。共培养后,ATB-si RNA组中FN和ColⅠ的mRNA表达水平较NC-si RNA组均降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。ATB-si RNA组的ColⅢmRNA的表达水平与NC-si RNA组相比差异无统计学意义(P>0.05)。ATB-si RNA组中FN、ColⅠ和ColⅢ的蛋白相对表达量较NC-si RNA组均降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论TGF-β1可刺激成纤维细胞增殖,LncRNA-ATB表达上调,FN、ColⅠ和ColⅢ的mRNA和蛋白表达升高,且细胞中LncRNA-ATB的表达与纤维化因子表达呈正相关。干扰LncRNA-ATB后,FN、ColⅠ的mRNA相对表达量降低、FN、ColⅠ和ColⅢ蛋白表达升高,提示LncRNA-ATB在矽肺纤维化中起到调控作用。
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