论文部分内容阅读
刚地弓形虫（Toxoplasmagondii）是一种人畜共患的寄生虫，可导致机会性人兽共患寄生虫病，在人体内通常以包囊的形式存在，免疫缺陷人群感染弓形虫则可能导致较严重的后果。弓形虫的虫体前端有称之为前端复合体的特殊构造，其内有类锥体和分泌器官，即棒状体和致密颗粒。这些分泌器官分泌出大量的蛋白质效应分子进入宿主细胞，在弓形虫入侵宿主细胞过程中起了很大的作用，而且部分蛋白质效应分子能通过调控宿主的信号传导通路来调节宿主的免疫应答、抑制宿主细胞的凋亡等，研究也揭示了弓形虫感染明显改变了宿主细胞的各种RNA和蛋白质的表达，尤其是与宿主细胞免疫应答相关的各种蛋白效应分子的表达量发生明显改变。弓形虫感染可能诱导了宿主细胞的lncRNAs差异表达，而差异表达的lncRNAs调控宿主细胞的基因表达而引起蛋白效应分子的表达量变化，从而来调控宿主细胞抗弓形虫感染的免疫应答。
根据本课题组前期的研究基础，利用对速殖子和未感染弓形虫宿主细胞的基因芯片转录组数据分析，发现，Lnc-UNC93B1和靶基因UNC93B1负调控的关系。弓形虫感染宿主细胞以后，Lnc-UNC93B1上调，UNC93B1下调。但是
Lnc-UNC93B1是如何调控UNC93B1的机制，Lnc-UNC93B1对弓形虫感染宿主细胞后会起到治疗还是预防的作用，以及Lnc-UNC93B1究竟是在速殖子阶段还是转化为缓殖子以后发挥抗弓形虫的作用，有待我们接下来的研究。
目的
探索Lnc-UNC93B1在细胞质里和靶基因UNC93B1的作用机制，以及Lnc-UNC93B1的功能，为弓形虫感染宿主的治疗提供一定的理论依据。
方法
1.弓形虫感染的人成纤维细胞差异表达LncRNAs与mRNAs筛选以及生物信息学分析
1.1通过基因芯片，分析正常组、速殖子感染组、缓殖子感染组3组长链非编码RNA和mRNA的差异表达。
1.2根据GO注释，对差异倍数大于5倍的mRNA进行GO分析。
1.3根据pathway分析，对差异大于5倍的mRNA进行pathway分析。
2.Lnc-UNC93B1的功能和机制的探索
2.1分部提取RNA，确定Lnc-UNC93B1的在细胞内的定位。
2.2生物信息学预测Lnc-UNC93B1与UNC93B1的结合位点。
2.3构建Lnc-UNC93B1正常序列以及突变序列的双荧光素酶质粒，转染293T细胞，检测是否有直接与UNC93B1结合发挥作用。
2.4扩增本课题组前期构建的Lnc-UNC93B1的腺病毒，并且验证其干扰效果，以及免疫荧光检测转染效率。
2.5构建过表达的Lnc-UNC931腺病毒，qPCR验证是否有过表达，以及免疫荧光检测转染效率。
2.6干扰和过表达Lnc-UNC93B1检测，是否对弓形虫的增殖、以及导致弓形虫从速殖子转向缓殖子产生影响，是对治疗有效，还是对预防有效。
结果
1.基因芯片数据分析，筛选出差异显著的LncRNA和mRNA（大于5倍，P＜0.05）。
用DAVID进行GO分析和pathway分析。在速殖子感染成纤维细胞的数据中显示，UNC93B1下调2.7倍，Lnc-UNC93B1上调7.8倍，在缓殖子感染成纤维细胞的基因芯片数据，UNC93B1下调2.7倍，Lnc-UNC93B1上调7.8倍。结合前期的研究结果，Lnc-UNC93B1和靶基因UNC93B1寄可作用于速殖子也可作用于缓殖子，那么lnc-UNC93B1对弓形虫的作用是在速殖子阶段还是将速殖子转为缓殖子以后，还有待进一步的研究。
2.用lifegene分部提取RNA剂盒，提取RNA，PCR产物跑胶显示Lnc-UNC93B1在成纤维细胞和巨噬细胞的细胞质和细胞核内都存在。
3.生物信息学预测出Lnc-UNC93B1和UNC93B1的结合位点，合成UNC93B1结合区域的正常序列和突变序列，成功构建psciCHE2的质粒，转染293T细胞，酶标仪检测结果显示，Lnc-UNC93B1是直接与UNC93B1结合。
4.构建过表达的Lnc-UNC93B1腺病毒，转染了人包皮成纤维细胞和巨噬细胞，qPCR检测结果显示，在人包皮成纤维细胞中Lnc-UNC93B1表达上调1.3倍，UNC93B1表达下调0.4倍，在巨噬细胞中Lnc-UNC93B1表达上调1.5倍，UNC93B1表达下调0.5倍。免疫荧光检测，转染效率达95%。
5.为了探索Lnc-UNC93B1对感染弓形虫后是治疗作用还是预防作用，过表达Lnc-UNC93B1，分成了先转染过表达PHBAd-u6-GFP-shRNA组和先转染ME49虫株组，干扰Lnc-UNC93B1，分成了先转染ADM-GFP-shRNA组，然后ME49株感染细胞，来检测预防作用，先ME49株感染细胞，然后转染ADM-GFP-shRNA干扰腺病毒组，来检测治疗作用。过表达Lnc-UNC93B1,第一组先PHBAd-u6-GFP空载和PHBAd-u6-GFP-shRNA转染细胞，再转ME49株弓形虫感染成纤维细胞，qPCR结果显示将Lnc-UNC93B1过表达以后，在12H和24H的时候，弓形虫的数量明显增加。第二组是，先转ME49株弓形虫感染成纤维细胞，转染PHBAd-u6-GFP空载和过表达PHBAd-u6-GFP-shRNA转染细胞，结果显示,此时过表达的Lnc-UNC93B1对弓形虫的增殖没有显著影响。
6.对于干扰Lnc-UNC93B1,分成先转染干扰的ADM-GFP-shRNA进成纤维细胞组和先ME49感染成纤维细胞组。第一组，干扰的ADM-GFP-shRNA进成纤维细胞,后转染转ME49株弓形虫感染细胞,qPCR检测结果显示，12H、24H、36H弓形虫的增殖明显被抑制。第二组，先转ME49株弓形虫感染成纤维细胞，再转染ADM-GFP空载和干扰的Lnc-UNC93B1进成纤维细胞，qPCR检测结果显示，12H、24H弓形虫的增殖明显被抑制。
结论
本研究，分析了基因芯片弓形虫感染人包皮成纤维细胞的48H后的表达谱变化，并且结合本课题组前期关于lncRNA的研究，通过GO分析和KEGG分析，发现Lnc-UNC93B1在弓形虫感染中至关重要；为了进一步研究Lnc-UNC93B1的机制，我们通过生物信息学的预测发现，lncUNC93B1是反义的LncRNA;利用分部提取RNA的方法,确定Lnc-UNC93B1是在细胞质和细胞核都有存在;利用生物信息学预测Lnc-UNC93B1和靶基因UNC93B1的结合位点，构建成功正常序列和突变序列的双荧光素酶的质粒，转染293T细胞，酶标仪监测结果，显示，Lnc-UNC93B1和UNC93B1是直接结合发挥作用;从功能缺失和功能获得两方面，对Lnc-UNC93B1的功能进行研究，发现，Lnc-UNC93B1能够显著影响，弓形虫的增殖。
根据本课题组前期的研究基础，利用对速殖子和未感染弓形虫宿主细胞的基因芯片转录组数据分析，发现，Lnc-UNC93B1和靶基因UNC93B1负调控的关系。弓形虫感染宿主细胞以后，Lnc-UNC93B1上调，UNC93B1下调。但是
Lnc-UNC93B1是如何调控UNC93B1的机制，Lnc-UNC93B1对弓形虫感染宿主细胞后会起到治疗还是预防的作用，以及Lnc-UNC93B1究竟是在速殖子阶段还是转化为缓殖子以后发挥抗弓形虫的作用，有待我们接下来的研究。
目的
探索Lnc-UNC93B1在细胞质里和靶基因UNC93B1的作用机制，以及Lnc-UNC93B1的功能，为弓形虫感染宿主的治疗提供一定的理论依据。
方法
1.弓形虫感染的人成纤维细胞差异表达LncRNAs与mRNAs筛选以及生物信息学分析
1.1通过基因芯片，分析正常组、速殖子感染组、缓殖子感染组3组长链非编码RNA和mRNA的差异表达。
1.2根据GO注释，对差异倍数大于5倍的mRNA进行GO分析。
1.3根据pathway分析，对差异大于5倍的mRNA进行pathway分析。
2.Lnc-UNC93B1的功能和机制的探索
2.1分部提取RNA，确定Lnc-UNC93B1的在细胞内的定位。
2.2生物信息学预测Lnc-UNC93B1与UNC93B1的结合位点。
2.3构建Lnc-UNC93B1正常序列以及突变序列的双荧光素酶质粒，转染293T细胞，检测是否有直接与UNC93B1结合发挥作用。
2.4扩增本课题组前期构建的Lnc-UNC93B1的腺病毒，并且验证其干扰效果，以及免疫荧光检测转染效率。
2.5构建过表达的Lnc-UNC931腺病毒，qPCR验证是否有过表达，以及免疫荧光检测转染效率。
2.6干扰和过表达Lnc-UNC93B1检测，是否对弓形虫的增殖、以及导致弓形虫从速殖子转向缓殖子产生影响，是对治疗有效，还是对预防有效。
结果
1.基因芯片数据分析，筛选出差异显著的LncRNA和mRNA（大于5倍，P＜0.05）。
用DAVID进行GO分析和pathway分析。在速殖子感染成纤维细胞的数据中显示，UNC93B1下调2.7倍，Lnc-UNC93B1上调7.8倍，在缓殖子感染成纤维细胞的基因芯片数据，UNC93B1下调2.7倍，Lnc-UNC93B1上调7.8倍。结合前期的研究结果，Lnc-UNC93B1和靶基因UNC93B1寄可作用于速殖子也可作用于缓殖子，那么lnc-UNC93B1对弓形虫的作用是在速殖子阶段还是将速殖子转为缓殖子以后，还有待进一步的研究。
2.用lifegene分部提取RNA剂盒，提取RNA，PCR产物跑胶显示Lnc-UNC93B1在成纤维细胞和巨噬细胞的细胞质和细胞核内都存在。
3.生物信息学预测出Lnc-UNC93B1和UNC93B1的结合位点，合成UNC93B1结合区域的正常序列和突变序列，成功构建psciCHE2的质粒，转染293T细胞，酶标仪检测结果显示，Lnc-UNC93B1是直接与UNC93B1结合。
4.构建过表达的Lnc-UNC93B1腺病毒，转染了人包皮成纤维细胞和巨噬细胞，qPCR检测结果显示，在人包皮成纤维细胞中Lnc-UNC93B1表达上调1.3倍，UNC93B1表达下调0.4倍，在巨噬细胞中Lnc-UNC93B1表达上调1.5倍，UNC93B1表达下调0.5倍。免疫荧光检测，转染效率达95%。
5.为了探索Lnc-UNC93B1对感染弓形虫后是治疗作用还是预防作用，过表达Lnc-UNC93B1，分成了先转染过表达PHBAd-u6-GFP-shRNA组和先转染ME49虫株组，干扰Lnc-UNC93B1，分成了先转染ADM-GFP-shRNA组，然后ME49株感染细胞，来检测预防作用，先ME49株感染细胞，然后转染ADM-GFP-shRNA干扰腺病毒组，来检测治疗作用。过表达Lnc-UNC93B1,第一组先PHBAd-u6-GFP空载和PHBAd-u6-GFP-shRNA转染细胞，再转ME49株弓形虫感染成纤维细胞，qPCR结果显示将Lnc-UNC93B1过表达以后，在12H和24H的时候，弓形虫的数量明显增加。第二组是，先转ME49株弓形虫感染成纤维细胞，转染PHBAd-u6-GFP空载和过表达PHBAd-u6-GFP-shRNA转染细胞，结果显示,此时过表达的Lnc-UNC93B1对弓形虫的增殖没有显著影响。
6.对于干扰Lnc-UNC93B1,分成先转染干扰的ADM-GFP-shRNA进成纤维细胞组和先ME49感染成纤维细胞组。第一组，干扰的ADM-GFP-shRNA进成纤维细胞,后转染转ME49株弓形虫感染细胞,qPCR检测结果显示，12H、24H、36H弓形虫的增殖明显被抑制。第二组，先转ME49株弓形虫感染成纤维细胞，再转染ADM-GFP空载和干扰的Lnc-UNC93B1进成纤维细胞，qPCR检测结果显示，12H、24H弓形虫的增殖明显被抑制。
结论
本研究，分析了基因芯片弓形虫感染人包皮成纤维细胞的48H后的表达谱变化，并且结合本课题组前期关于lncRNA的研究，通过GO分析和KEGG分析，发现Lnc-UNC93B1在弓形虫感染中至关重要；为了进一步研究Lnc-UNC93B1的机制，我们通过生物信息学的预测发现，lncUNC93B1是反义的LncRNA;利用分部提取RNA的方法,确定Lnc-UNC93B1是在细胞质和细胞核都有存在;利用生物信息学预测Lnc-UNC93B1和靶基因UNC93B1的结合位点，构建成功正常序列和突变序列的双荧光素酶的质粒，转染293T细胞，酶标仪监测结果，显示，Lnc-UNC93B1和UNC93B1是直接结合发挥作用;从功能缺失和功能获得两方面，对Lnc-UNC93B1的功能进行研究，发现，Lnc-UNC93B1能够显著影响，弓形虫的增殖。