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血管抑素(Angiostatin,AS)是O’Reilly等于1994年从Lewis肺癌小鼠血清和尿液中分离出的能够特异性抑制肿瘤血管内皮细胞增生的因子。AS是大分子物质纤溶酶原的一个片段,相对分子量为38KD。自从发现AS能强烈抑制血管内皮细胞生长和血管的新生,其生物学效应和作用方式即引起了人们极大的关注。AS作用机制不十分明了,内化可谓一个热点,人们公认的受体大致为αⅤβ3、ATP合成酶及Angiomotin等。本研究以125I标记的AS为放射性配基,探讨ECV304细胞内化AS的能力以及125I-AS杀伤ECV304细胞的剂量效应关系,并探讨温度、时间及125I-AS浓度等因素对ECV304细胞内化AS的影响,为125I-AS作为AS受体阳性肿瘤的放射治疗药物提供实验依据。目的:利用125I标记AS,研究标记产物125I-AS的体外稳定性及生物活性,探讨人脐静脉内皮细胞系ECV304细胞内化AS的能力及125I-AS杀伤ECV304细胞的效应,并探讨温度、时间及125I-AS浓度等因素对ECV304细胞AS受体内化的影响。方法:1、利用弹性蛋白酶有限水解法制备AS,水解产物经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定后,用Ch-T法进行标记,用纸层析法测标记率。2、用Sephadex-G50柱对标记产物进行纯化,纯化产物分别加入牛血清白蛋白(BSA)、生理盐水及不同摩尔比的半胱氨酸(Cys)以观察其体外稳定性。并利用细胞生长抑制实验检测标记纯化产物的生物活性。3、采用放射性配基结合分析法,以125I-AS为放射性配基,37℃条件下, AS受体阳性细胞ECV304与125I-AS共同保温不同时间后,分别检测细胞的受体内化率;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测不同剂量125I-AS、游离125I及AS对ECV304细胞作用24,48,72,96 h的杀伤作用。4、于4℃、24℃及37℃条件下,固定浓度125I-AS与ECV304细胞共同保温不同时间后,分别检测细胞的受体内化率。5、37℃条件下,不同浓度125I-AS与ECV304细胞共同保温不同时间后,分别检测细胞的受体内化率。结果:1、蛋白水解产物经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定,相对分子量为38KD, 125I-AS标记率可达85%。2、125I-AS在生理盐水中1、4、24 h的解离率分别为2.3%、5.2%、8.0%,在10g/L BSA中1、4、24h的解离率分别为4.6%、9.1%、11.0%。在不同摩尔比Cys溶液中孵育,125I-AS存在不同程度的解离,摩尔比在5以下时,4 h的解离率不超过11%,表明标记产物在体外较稳定。分别用不同浓度125I-AS和AS作用于ECV304细胞,并以6-氨基己酸作为对照,发现125I-AS及AS对ECV304细胞增殖均有明显的抑制作用,且125I-AS的作用强于单纯的AS,表明125I-AS具有较强的生物活性。3、37℃条件下温育,125I-AS与AS受体结合并迅速使受体发生内化。0.5h内,受体内化率、膜受体结合率及细胞总结合率均随时间的延长而增加,在0.5h时,受体内化率为(12.6±1.1)%,膜受体结合率为(19.1±2.2)%,细胞总结合率为(31.7±1.6)% (r=0.814, P<0.05)。0.5h后,受体内化率随时间的延长继续增加,膜受体结合率随时间的延长逐渐减少,至24h时,受体内化率达(28.0±3.0)%,膜受体结合率为(10.8±1.4)%,细胞总结合率为(38.8±2.3)%(r=-0.681, P<0.05)。125I -AS对ECV304细胞杀伤作用呈剂量-效应、时间-效应关系。以370 KBq/ml 125I-AS作用96h的杀伤效应最大,明显强于Na125I或AS对ECV304细胞的抑制效应,细胞抑制率达(79.4±3.7)% (F=312.9013 ,P<0.01)。4、4℃时,受体内化率较低,24℃时,受体内化率有所增加,37℃时,受体内化率较高;37℃时,随125I-AS浓度增大,受体内化率降低;不同温度、浓度时,受体内化率均随时间延长而增加。结论:用Ch-T法进行125I-AS标记简单易行,125I-AS对ECV304细胞的生长有明显抑制作用,有较强的生物活性,标记产物在体外较稳定。125I-AS可在AS受体介导下内化进入并杀伤ECV304细胞,呈剂量-效应、时间-效应关系。ECV304细胞AS受体内化受温度、时间及125I-AS浓度等因素影响,呈温度-效应、时间-效应关系,随125I-AS浓度增加,内化率降低。