DNA甲基化是一种在植物、哺乳动物和一些真菌中保守的表观遗传标记,主要指在甲基转移酶催化下将S-腺苷甲硫氨酸上的甲基基团转移到DNA胞嘧啶上,它在转基因和内源基因的转录沉默、次级突变、印记、X染色体失活等表观遗传过程中起着重要的作用。在植物中,大约三分之一的甲基化DNA位点与小RNA有关,这种甲基化方式称为RNA介导的DNA甲基化（Rd DM）,Rd DM被认为是植物中普遍存在的一种转录沉默机制。该过程由几种蛋白质组成,它们加工和产生si RNAs、修饰组蛋白、重塑染色质并使所有序列的胞嘧啶发生甲基化,这些蛋白质主要包括由DNA甲基转移酶、组蛋白修饰酶、染色质重塑蛋白、植物特异性RNA聚合酶等。尽管DNA甲基化有助于稳定、长期和可遗传的沉默,但在某些情况下,DNA甲基化水平可以通过DNA去甲基化的机制迅速改变,DNA甲基化和去甲基化的迅速转化,可以更加动态地调节基因组稳定。在植物中,活性DNA去甲基化主要是通过一小群双功能DNA糖化酶进行的,包括ROS1、DME、DML2和DML3。EFD（Exine Formation Defect）是本实验室发现的在花粉早期调控中发挥重要作用的基因,蛋白质三维结构分析发现EFD具有DNA甲基转移酶典型结构,体外酶活实验也验证其具有DNA甲基转移酶活性。在植物中与生殖发育有关的甲基转移酶知之较少,EFD的发现和研究具有重要意义。本论文旨在探究EFD是否通过Rd DM机制发挥甲基转移酶催化作用,以及EFD甲基转移酶与ROS1去甲基转移酶家族是否存在相互作用关系。目前得到的结果如下:1.为了研究EFD在Rd DM过程中的作用,我们构建了含有α启动子的Target和Silencer载体,分别转入拟南芥中,通过荧光和PCR筛选到纯合稳定的双载体系统,称为Target/Silencer系统。2.将efd与Target/Silencer系统杂交筛选出纯合株系,另外选取已知为Rd DM元件的基因突变体（drd1、dms3、drm2）与Target/Silencer系统杂交筛选出纯合株系,作为阳性对照组。亚硫酸盐测序结果显示,EFD在α启动子的Rd DM过程中不起直接作用,但有间接作用。为了进一步验证,对成熟子叶胚荧光进行观察,结果与甲基化水平一致。3.为了再次验证EFD在Rd DM过程中的作用,我们得到含有RD29A-LUC系统的种子,通过杂交方式,获得含有EFD突变和未突变的RD29A-LUC纯合株系,通过亚硫酸盐测序结果显示,EFD在RD29A启动子的Rd DM过程中没有明显的直接或间接作用。4.EFD与ROS1及其同源基因DML2、DML3之间的关系。我们得到ROS1及其同源基因突变体,分别检测at1g26400、ERT1、ERT2和Z3在相应突变体中的甲基化水平,结果显示,EFD不调控ROS1靶基因at1g26400,ROS1、DML3与EFD一起协同调控了ERT1、ERT2、Z3位点的甲基化修饰,另一个同源蛋白DML2并不调控ERT1、Z3,但在ERT2位点处可以发挥协同作用。后续的实时荧光定量和Hpa II酶切实验结果与甲基化检测结果基本一致。