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蜡状芽孢杆菌(Bacillus Cereus)TSO2是由本研究室自主分离到的一株具有生防作用的菌株,经室内外药效试验证明该菌株对草莓白粉病有较强的拮抗作用。为了解决传统的培养计数方法检测微生态调节剂中益生菌种的难题,从而为微生态调节剂产品的鉴定和质量监控提供新的技术支持,本试验从分子水平上对该菌种进行了鉴别,具体试验结果如下:
参照中华人民共和国国家标准农药田间药效试验准则,在室外条件下进行蜡状芽孢杆菌TSO2对草莓白粉病的药效防治试验。试验结果表明:蜡状芽孢杆菌TSO2可以防治草莓白粉病,活菌数在3×10<7>CFU/ml以上的浓度可达到理想的作用效果,最高防效可达到52.23%;抑制作用是活菌和菌分泌的抑菌物质共同作用的结果。在蜡状芽孢杆菌防治草莓白粉病田间试验的基础上,在室内条件下初步探讨了蜡状芽孢杆菌防治草莓白粉病的机理。研究结果表明:蜡状芽孢杆菌可抑制病原菌的定殖,从而达到防治草莓白粉病的效果。
通过PCR扩增TSO2的16s rDNA全长片段,测序后输入GenBank中与已知序列进行比较分析,该序列与蜡状芽孢杆菌16S rDNA序列同源性达到99%。证明:TSO2是一株蜡状芽孢杆菌菌株,从分子水平上对TSO2进行了分子鉴定,采用RAPD-PCR方法对蜡状芽孢杆菌TSO2及其亲缘关系相近的5株芽孢杆菌(地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌)进行了RAPD条带特异性分析。采用本研究优化的RAPD方法,利用筛选出的6个引物,从蜡状芽孢杆菌TSO2基因组中筛选获得了一条513 bp的特异RAPD标记,利用分子克隆技术将该特异标记转化为稳定的SCAR标记。根据序列分析设计特异性引物进行目的片段扩增,结果证明此引物只在TSO2中扩增得到目的片段,而其余13株参照菌株(7株芽孢杆菌,5株乳酸菌,1株沼泽红假单胞菌)扩增为阴性,从而证明试验得到了在种水平上对该菌种进行准确鉴定的特异标记。
在得到蜡状芽孢杆菌TSO2种水平上鉴定的特异标记的基础上,通过PCR条件的优化,特异引物敏感性的检测,以及蜡状芽孢杆菌TSO2在叶面定殖情况的研究,初步建立了一套快速有效鉴定蜡状芽孢杆菌TSO2的分子方法,为进一步的TSO2类似产品的研究开发奠定了分子检测基础。