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目的构建SIRT1/2/3基因的原核表达载体p ET28a-SIRT1/2/3,转化E.coli BL21(DE3)并表达。制备SIRT1/2/3重组蛋白,建立SIRT1/2/3的酶活性筛选方法,并进行化合物的活性筛选评价。方法1.p ET28a-SIRT1/2/3重组质粒的构建与鉴定应用PCR方法扩增SIRT1/2/3目的基因,1%低熔点琼脂糖凝胶电泳分离扩增目的基因片段,DNA凝胶回收试剂盒回收。基因片段经Bam HI和Not I双酶切,酶切产物经1%低熔点琼脂糖凝胶电泳分离纯化,插入经相同双酶切的载体p ET-28a(+)。连接产物以冷Ca Cl2法转化E.coli JM109,并行卡那霉素筛选,挑取单克隆菌落,提取质粒,酶切鉴定,送检测序。2.SIRT1/2/3蛋白的表达纯化将测序正确的质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,培养OD600为0.4-0.8时,用1 m M IPTG于16℃诱导过夜。离心收集菌体,-20℃至少冻存过夜。将菌体重悬,超声破菌后离心取上清液。重组蛋白用Ni-NTA树脂亲和层析法进行纯化。以约10 m L体积的Ni-NTA树脂填柱,5倍NTA体积的无咪唑缓冲液平衡镍柱,再用20mmol/L-200 mmol/L咪唑缓冲液连续洗脱,收集洗脱液,行SDS-PAGE分析。3.SIRT1/2/3酶学活性测定方法的建立从SIRT1/2/3催化的底物蛋白中选取催化位点(乙酰化的赖氨酸残基)附近的一个小肽段,在其之后连接上荧光分子(AMC),在与肽段连接的情况下,荧光分子不能被激发产生荧光,但当SIRT蛋白将赖氨酸残基上的乙酰基团转移之后,荧光分子可以被胰蛋白酶剪切释放出来,从而被激发释放出荧光。本课题中所用的底物肽段来源于p53蛋白,其序列为:Ac-Arg-His-Lys-[Lys-(Ac)]-AMC。4.酶活性评价方法催化反应在60μL的反应液中进行(75μM NAD+,25μM底物肽段,SIRT蛋白和不同浓度的化合物),37°C放置1个小时之后向反应溶液中加入60μL的反应终止液(50 m M Tris-HCl,p H8.0,100 m M Na Cl,60000 unit Trypsin和4 m M nicotinamide),37°C放置20 min。将酶标仪参数设置为激发光355nm,吸收光为460nm,测定吸收强度。结果1.重组原核表达载体的构建经PCR扩增的SIRT1基因全长2241bp,SIRT2基因全长1170bp,SIRT3基因片段长度1000bp,经测序证明准确无误,无读码错误。将经Bam HI和Not I双酶切后回收的基因克隆片段和p ET28a(+)片段连接,成功构建重组表达载体p ET28a(+)-SIRT1/2/3,转化E.coli JM109,筛选出阳性菌落。将阳性菌落提取质粒,经PCR后电泳,可见与目的片段大小相似的特异性条带,提示重组表达载体p ET28a-SIRT1、p ET28a-SIRT2、p ET28a-SIRT3构建成功。2.重组蛋白表达纯化重组质粒p ET28a-SIRT1/2/3转化到BL21(DE3)感受态细菌,经1 mM IPTG诱导表达,在Ni-NTA亲和层析中采用不同浓度咪唑进行梯度洗脱,最后将蛋白的咪唑溶液脱盐超滤,得到较纯的SIRT1/2/3重组蛋白。3.SIRT1/2/3酶活性测定SIRT1/2/3蛋白的酶活性,在已经建立的酶反应体系中分别加入不同浓度的底物肽段和NAD+,通过测定荧光强度来计算SIRT1-3蛋白的Km值。4.化合物的筛选评价天然产物白藜芦醇被报道具有SIRT1的激活活性,但是对于同一家族的SIRT2/3却没有激活活性。我们测定了白藜芦醇的活性从而验证我们建立的酶活性测定方法。结论1.成功构建了SIRT1/2/3的原核表达载体p ET28a-SIRT1、p ET28a-SIRT2、p ET28a-SIRT3。2.转化重组表达载体p ET28a-SIRT1/2/3于E.coli BL21(DE3),成功制备纯度较高重组蛋白。3.建立了其酶活性筛选方法,完成了白藜芦醇的SIRT1/2/3活性筛选。