【目的】 分子生物学应用于神经外科后人们将对疾病的过程和新疗法产生新的认识和更深入的了解，研究和治疗的各种分子策略也会不断更新和完善。新世纪伊始，人类基因组计划提前完成，基因组计划完成后做些什么？是生命科学界有识之士正在考虑的大问题。恶性肿瘤是生命科学中一大难题，基因治疗研究始于恶性胶质瘤，基因组学和基因信息学将是今后相当长时间内的热门话题。目前已发展了多种强有力的生物信息分析技术极大地提高了研究效率。虽然肿瘤细胞处于一种未分化的状态，但是仍然保留着分化潜能，在某种药物的诱导下可以趋向分化。这一现象已经成为胶质瘤治疗研究的一个新的靶目标。本实验从多种诱导分化剂中优选出对胶质瘤诱导分化效果最强的药物，以它诱导胶质瘤细胞分化。旨在建立诱导分化的超早期和晚期表达发生变化的基因谱，克隆胶质瘤分化相关基因，探讨人脑胶质瘤细胞诱导分化的分子机制，为胶质瘤的分子诊断和基因治疗打基础。【方法】1.胶质瘤细胞株的建立和正常人脑星形胶质细胞的培养。 人掘破惋右扭取话辱分a基因蘑例嗟立及极失基因肿克隆 中文苟要 常规培养胶质瘤细胞。原代培养正常脑组织。在相差显微镜下用 虹吸管吸取单个SHG44细胞，加滋养细胞共培养，建立单克隆的 胶质瘤细胞株。 2．分化剂的筛选和分化程度鉴定。 用MTT法检测细胞增殖能力，常规Giemsa染色或H干染色观察细 胞形态，双层软琼脂法检测克隆形成率，流式细胞术测细胞周期 动力学，免疫荧光测GFAP表达，划痕法检测细胞运动能力。 3·cDNA array技术建立诱导分化基因谱。： 应用 BioRobotics公司的自动点膜仪制备dNA array膜（挑克隆， 摇菌，抽质粒，PCR，点膜），抽提RNA，分离mRN，用a／P七ATP 标记成探针，与array膜杂交，结果用磷屏信号扫描分析，多点 杂交验证。 4．随机引物差异展示技术克隆胶质瘤诱导分化相关基因。 对苯丁酸钠诱导前后的胶质瘤细胞抽提RNA，用随机引物进行逆转 录和 PCR，掺入 a－nzP－dCTP，PAGE电泳，放射自显影。回收并扩 增差异条带，SSCP纯化，dot blot、Northern blot验证，最后 克隆差异基因片段，测序，生物信息学分析。 【结果】 1．三个细胞株的特征和正常星形胶质细胞的培养： 单细胞接种 7天后，共得到25个克隆，命名为洲G叶41至．SHG－44－25。以其中的 9号、17号、15，号分别代表高、中、低分 化，作重点观察。在形态学、DNA含量、GFAP表达、细胞运动能 力、裸鼠致瘤能力等方面，9号细胞均显示了较为恶性的生物学 特征。分别从正常胎儿和正常成人脑组织培养出正常星形胶质细 巨巨 2 入拒晒对和图瓤握样异分砧基历皆肘窟立及赦尖基毋肘兑谨 中艾博要 胞，经GFAP免疫组化鉴定绝大部分细胞为强阳性。 2．分化剂的优选：－通过对细胞增殖曲线测定了 HMBA、DM、BA、dBcM、SpA、 SPB、N％ASO。等药物的半数抑制浓度。观察了诱导分化后的形态 学变化。最后确定以苯丁酸钠为研究药物。 3．胶质瘤细胞诱导分化的鉴定： 诱导分化后细胞增殖明显受抑。对照组软琼脂克隆出现早，数量 多，直径大；诱导分化组大多数细胞不能形成克隆。流式细胞仪 检测 DNA含量对照组 S期高达 3 5．l％，呈典型恶性肿瘤特征；诱 导分化组呈时间依赖性G；厄。期增高，S期降低，提示G；期阻滞。 形态学、GFAP表达、细胞运动能力经检测亦符合诱导分化表现。 4．建立基因谱。 从苯丁酸钠诱导前、诱导后Zh和6大三个样品总RNA中分离得到 了足够的 mRNA，标记为探针，进行 cDNA array。扫描仪扫描得到 了l，8000个基因的表达数据，取其表达差异两倍以上的基因98 个，到Genebank数据库中查询相关资料，进行初步分类，建立了 初步的诱导分化相关基因表达谱。 5．RAPoD干CR克隆诱导分化相关基因。 应用RAP干D得到了基因表达的指纹图谱，回收了部分正常与肿 瘤、诱导2小时、4天与对照之间的差异基因。二次PCR扩增的 产物长度约在200士 之间。基因的SSCP电泳迁移率基因的一 级结构有关，我们利用SSCP将差异基因片段进行了纯化。点杂交