水稻白叶枯病(rice bacterial blight)是由水稻黄单胞杆菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)引起的一种细菌性病害,是水稻生产中最严重的病害之一。申嗪霉素(shenqinmycin)是由铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)M18菌株分泌的一种微生物源抗生素,其主要有效成分为吩嗪-1-羧酸(phenazine-l-carboxylic acid, PCA),对多种植物病原菌具有抑制效果,具有高效、低毒和环境相容性好的特点。申嗪霉素对水稻白叶枯病菌具有强烈的离体及活体抑制活性,是一种防治水稻白叶枯病的潜在药剂。本文以蛋白质组学技术为主,生化与分子技术为辅,系统研究了申嗪霉素对水稻白叶枯病菌的生物学效应机制,为申嗪霉素在水稻生产上的应用提供了依据。1.水稻白叶枯病菌蛋白质组数据库的建立使用双向电泳技术构建了水稻白叶枯病菌的蛋白质组参考图谱,并利用基质辅助激光解析(／吸附)电离串级飞行时间质谱仪(MALDI-TOF/TOF MS)鉴定出了双向电泳凝胶上的628个蛋白点,这些蛋白点属于469种不同的蛋白质。得到的蛋白点数据组已经上传至World-2DPAGE网站,并构建了数据库,登录号为0044。使用KEGG和NCBI数据库对628个蛋白点进行生物信息学分析并分类,最终根据蛋白功能可将其分成15大类,其中糖代谢、氨基酸代谢、运输及蛋白折叠与降解相关蛋白所占比例最大,均在10%以上。对参考图谱中的蛋白点进行丰度分析,发现丰度最高的蛋白为糖代谢、蛋白折叠与降解、运输、翻译及能量代谢相关蛋白。综上所述,我们建立了水稻白叶枯病菌蛋白质组数据库,为后续的比较蛋白组学研究奠定了基础。2.水稻白叶枯病菌对申嗪霉素的药敏性生物效应及蛋白质组学分析本研究测定了水稻白叶枯病菌的总糖、总蛋白和胞外多糖含量,发现使用申嗪霉素处理2d后单位菌量的总糖、总蛋白含量均高于对照；使用0.5gg/mL以下的申嗪霉素处理菌体时,5d后胞外多糖含量显著高于对照,处理浓度达到1μg/mL时,胞外多糖含量显著降低。利用荧光探针法测定了申嗪霉素刺激水稻白叶枯病菌活性氧积累的情况,发现在2μg/mL浓度处理时活性氧积累达到阳性对照水平。测定了申嗪霉素不同处理时间对水稻白叶枯病菌CAT和SOD酶活性的影响,结果表明申嗪霉素能在多个时间点抑制这两种酶的活性。利用透射电镜观察了申嗪霉素对水稻白叶枯病菌形态结构的影响,发现申嗪霉素刺激菌体产生了颗粒状物质与空泡状结构。比较了水稻白叶枯病菌和水稻细条斑病菌对过氧化氢的敏感性,结果表明水稻白叶枯病菌对过氧化氢极为敏感,而水稻细条斑病菌对过氧化氢具有较好的耐受性。使用荧光定量PCR技术比较了水稻白叶枯病菌和水稻细条斑病菌中三个编码CAT酶基因的转录水平,发现三个基因在水稻细条斑病菌中的表达水平均高于水稻白叶枯病菌,其中有两个基因转录水平差异倍数分别为11倍和3倍。采用双向电泳技术分析了申嗪霉素处理后水稻白叶枯病菌蛋白质组表达水平的变化,结果表明申嗪霉素抑制了水稻白叶枯病菌的糖代谢、能量代谢及营养吸收。利用微生物快速鉴定系统分析了申嗪霉素对水稻白叶枯病菌碳源利用能力的影响,从而确认了申嗪霉素能够抑制水稻白叶枯病菌的糖代谢。小麦赤霉病菌孢子萌发实验结果说明了申嗪霉素确实能够抑制能量代谢。敲除了水稻白叶枯病菌差异表达倍数较高的葡糖磷酸变位酶,并分析了突变体的表型,发现其致病力、对申嗪霉素的敏感性及申嗪霉素处理时的活性氧积累量均无特别明显的变化。测定了申嗪霉素对重要差异蛋白丙酮酸脱氢酶活性的影响,结果表明申嗪霉素对水稻白叶枯病菌的丙酮酸脱氢酶活性有一定抑制效果,但对小鼠肝脏和水稻叶片的丙酮酸脱氢酶活性影响不大。测定了申嗪霉素与呼吸链中氧化还原电位较低的NADH的氧化还原反应情况,发现在提供质子的情况下,申嗪霉素能够与NADH在体外快速发生反应。综合以上结果,我们发现申嗪霉素是一种氧化还原循环物质,氧化态的申嗪霉素与菌体内氧化还原电位较低的某些电子供体发生氧化还原反应,生成的还原态申嗪霉素持续与氧气反应生成活性氧,并变回氧化态。积累的活性氧会对细胞产生一系列不利的影响,并最终导致细胞死亡。菌体内氧化还原平衡状态被扰乱后,影响了菌体的糖代谢,从而导致能量产生减少,营养吸收能力被削弱。此外,申嗪霉素抑制了水稻白叶枯病菌的CAT和SOD酶活性,因此加剧了活性氧的积累。水稻白叶枯病菌的过氧化氢清除系统存在缺陷,无法及时清除积累的活性氧,导致其对申嗪霉素特别敏感。3.水稻白叶枯病菌对申嗪霉素的抗药性生物效应及蛋白质组学分析本研究采用药剂驯服的方法在含药平板上筛选到了四株抗申嗪霉素的水稻白叶枯病菌菌株,并利用水稻白叶枯病菌特异性引物进行PCR鉴定。测定了四株抗性菌株的致病力及其对申嗪霉素的敏感性,发现S-1菌株抗性倍数及致病力最高；对四株抗性菌株胞外多糖含量进行分析,结果表明胞外多糖含量的变化与申嗪霉素敏感性变化无相关性；使用荧光探针法测定了申嗪霉素处理后四株抗性菌株的活性氧积累量,发现S-1基本无活性氧积累。测定了野生型菌株ZJ173和抗性菌株S-1的活性氧清除酶活性,发现S-1的CAT酶活性显著高于ZJ173；利用双向电泳技术分析了野生型菌株ZJ173和抗性菌株S-1的蛋白质组表达情况,发现S-1的转运系统及能量代谢的增强与其抗性相关。综上所述,S-1对申嗪霉素的抗性可能是由两方面的因素引起的：一是转运系统以及能量代谢的增强引起的多药物外排系统的增强；二是抗性菌株CAT酶活性的上升。