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骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells ,BMSCs)作为种子细胞在骨组织工程中的研究已日趋深入,那么如何获得大量功能状态良好的细胞以及如何促进BMSCs向成骨细胞转化是目前研究的热点。影响BMSCs体外生长状态、细胞增殖能力和成骨分化能力的因素有很多,如血清、培养基、细胞接种密度、PH值、O2浓度、温度、湿度、剪切应力、生长因子等。L-型钙通道属于电压门控钙离子通道,是Ca2+进入细胞内的最主要通道之一,参与细胞增殖和细胞功能活动。研究发现在成骨细胞上存在L-型钙通道,并对成骨细胞增殖和细胞活性起重要作用。而成骨细胞主要来源于BMSCs,两者的生物学特性非常相似,所以推测L-型钙通道可能也参与了BMSCs的增殖和成骨分化过程。因此本研究通过阻断BMSCs上L-型钙通道,观察该通道对BMSCs生长状态以及成骨分化能力的影响,初步探讨L-型钙通道在BMSCs生长中的作用和进一步从分子水平探讨BMSCs成骨分化的机制。整个研究分为以下几个部分:(1)全骨髓贴壁筛选法体外分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)并传代,倒置显微镜观察细胞形态,通过诱导rBMSCs成骨、成脂分化进行细胞鉴定。结果:取第三代细胞进行成骨、成脂诱导。成脂诱导第7d,油红染色可见细胞内明显的红色脂滴,说明此细胞可以被诱导分化为成脂细胞,成骨诱导第21 d?时,茜素红染色可见细胞外基质中明显的矿化结节,说明此细胞可以被诱导分化为成骨细胞。结果表明,经全骨髓贴壁筛选法培养及传代而来的细胞,是具有多向分化潜能的骨髓间充质干细胞。?(2) RT-PCR技术检测SD大鼠BMSCs?钙通道的基因表达。RT-PCR结?果显示:L‐型钙通道亚基alC、CCHL2a mRNA以及T‐型钙通道亚基alG、CACNA1 mRNA均呈高表达。结果证实,SD大鼠BMSCs上存在L‐型钙离子通道,为下一步研究L‐型钙离子通道在rBMSCs增殖和成骨分化过程中的影响提供前体条件。并且,检测结果发现了SD大鼠BMSCs上还存在T‐型钙离子通道。?(3)取第三代rBMSCs,实验组加入L‐型钙通道阻断剂硝苯地平(nifedipine? ,Nif)阻断L‐型钙通道,对照组不加Nif,常规培养,MTT法检测两组细胞的增殖状态、流式细胞仪观察两组细胞的周期变化。结果:阻断L‐型钙通道后第3天开始,实验组OD值明显低于对照组,且有显著性差异(P<0.05);经Nif作用后,实验组的S期细胞比例为(19.22±4.91)% ,较对照组细胞的同时期比例(45.33±8.64)%明显减少,P<0.01。结果表明,阻断L-型钙通道可以抑制BMSCs的DNA合成进而抑制细胞的增殖。(4)? ?取第三代rBMSCs,实验组加入Nif阻断L‐型钙通道,进行rBMSCs成骨诱导,对照组不加药在相同条件下进行诱导成骨分化,碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测两组ALP活性、茜素红染色检测钙结节含量。结果:rBMSCs?成骨诱导第1、3、5? d,两组细胞内? ALP活性检测,实验组ALP活性较对照组明显降低,P<0.01,组间差异有统计学意义;Nif?阻断钙通道后第21天,rBMSCs?细胞矿化外基质的形成受到抑制,实验组中细胞钙化率为(4.29±2.24)%,明显低于对照组(23.66±5.52)%,P<0.05。结果表明,阻断rBMSCs?细胞上L‐型钙离子通道可以抑制细胞向成骨细胞分化。