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研究背景慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD;简称慢阻肺),是一种临床病理表现复杂的异质性疾病。其病理生理特点是进行性发展的气流受限,形成气流受限的病理基础在于气道重塑和肺泡破坏,主要与香烟及生物燃料造成直接破坏以及炎症损伤有关。气道上皮是有害颗粒的直接承受者,在气道损伤中首当其冲。气道上皮细胞发生损伤后迅速启动修复机制。基底细胞是气道上皮的干细胞群,在气道损伤后通过增殖、迁移并分化成新的上皮,完成修复过程。基底细胞功能紊乱在慢阻肺气道上皮损伤后的异常修复中发挥举足轻重的作用:如过度增殖会导致细胞增生,气道壁增厚;异常分化可以导致鳞状上皮化生、杯状细胞增多进而黏液高分泌,这些改变均与慢阻肺早期气道重塑病理表现密切相关。深入了解基底细胞的功能和调控机制,对于慢阻肺的早期干预具有重要的临床意义。TROP2(Trophoblast antigen 2,滋养层细胞表面抗原 2),是一种 TACSTD(tumor-associated calcium signal transducer,肿瘤相关钙信号转导蛋白)基因家族跨膜糖蛋白,其高表达可以为上皮源性肿瘤细胞的生长和侵袭提供重要信号。值得关注的是,新近研究证实TROP2具备调控干细胞生长的能力。Andrew S等研究发现,前列腺基底细胞中仅高表达TROP2的细胞具备成球能力和分化潜能。在小鼠肝脏中,TROP2可作为卵圆细胞(被认为肝脏干细胞)的标记,在肝损伤后可检测到其特异性表达于未分化的卵圆细胞中,且表达量和诱导损伤时间成正比。以上证据提示,TROP2在干细胞的更新和生长中发挥重要作用,然而TROP2在慢阻肺气道基底干细胞表达及其意义未见相关报道,针对此问题,本课题对慢阻肺患者气道上皮TROP2表达水平及其对基底细胞的调控作用进行研究。研究目的检测慢阻肺患者气道基底细胞TROP2表达情况,分析其对基底细胞增生、上皮间质转化(EMT)、炎症因子分泌等生物学行为的调控作用,探讨TROP2在慢阻肺气道上皮重塑中可能发挥的作用。研究方法1.慢阻肺患者气道基底细胞TROP2表达1.1病例选择选取山东大学齐鲁医院2012年至2014年因肺部病变行肺叶切除术患者,收集远离病变5cm以上肺组织标本。病例分组包括:慢阻肺吸烟组(24例),吸烟对照组(24例),和不吸烟对照组(24例)。1.2免疫组化染色检测气道上皮TROP2表达;基底细胞标志物Cytokeratin 5和TROP2免疫荧光双重染色对TROP2在气道上皮中的表达进行定位分析。1.3对TROP2表达水平和FEV%进行相关性分析。1.4免疫组化染色检测三组样本的气道上皮增生指数Ki67(%)。1.5对TROP2表达水平和气道上皮增生指数Ki67(%)进行相关性分析。2.TROP2对气道基底细胞增殖的影响及机制研究2.1气道基底细胞的分离、培养:选取就诊于山东大学齐鲁医院行常规纤维支气管镜的患者(包括肺功能正常者和轻、中度慢阻肺患者)进行上皮细胞刷检。应用BEGM培养基体外培养基底细胞。使用基底细胞标志物Cytokeratin 5、p63行免疫荧光双标记,鉴定气道基底细胞。2.2过表达及沉默TROP2基因:构建pcDNA3.1-TROP2质粒及siRNA-TROP2序列,采用脂质体Lipo 2000进行细胞转染。pcDNA3.1-TROP2转染至正常基底细胞使TROP2高表达,siRNA-TROP2转染至慢阻肺基底细胞使TROP2低表达。转染48小时后应用Western blot和RT-PCR方法验证转染效果。2.3实验分为处理组(TROP2基因转染或沉默的基底细胞)和对照组(包括阴性对照和空白对照),通过CCK-8检测、细胞周期检测、划痕实验明确TROP2上调或沉默对气道基底细胞增殖和损伤修复能力的影响。2.4 TROP2促气道基底细胞增殖机制研究:上调TROP2表达,Western blot方法检测磷酸化的ERK1/2水平,以及ERK下游信号分子细胞周期蛋白Cyclin D1的表达;为明确PERK1/2在TROP2促基底细胞增殖中的作用,使用ERK抑制剂U0126预处理细胞,检测ERK蛋白磷酸化水平及Cyclin D1表达水平;CCK-8检测基底细胞增殖情况。3.TROP2对气道基底细胞EMT样改变和炎症因子分泌的影响3.1慢阻肺气道基底细胞EMT标志物检测:免疫荧光双染检测慢阻肺及对照组的气道上皮中Cytokeratin 5及Vimentin(间质细胞标志物)表达。3.2 TROP2对气道基底细胞EMT标志物表达的影响:TROP2基因转染正常气道基底细胞,使TROP2过表达,Western blot检测EMT标志物E-cadherin及Vimentin变化;收集来自慢阻肺患者的气道基底细胞进行体外培养,沉默基底细胞TROP2后,检测EMT标志物变化。3.3 TROP2对基底细胞炎症因子分泌的影响:将pcDNA3.1-TROP2质粒载体转染气道基底细胞,应用ELISA方法检测TROP2过表达和对照组细胞上清液中IL-6、IL-8、IL-1 β、TNF-α表达水平。3.4炎症因子在TROP2促气道基底细胞EMT改变中作用的研究:IL-6、IL-8、IL-1β中和抗体预处理TROP2过表达基底细胞,Western Blot检测EMT标志物变化。3.5 ERK1/2在TROP2促基底细胞EMT改变和炎症因子分泌中作用的研究:使用ERK1/2抑制剂U0126预处理TROP2过表达基底细胞,ELISA方法检测上清液中IL-6、IL-8、IL-1β表达水平,Western Blot检测EMT标志物改变。结果1.肺组织标本研究1.1 一般资料比较:三组病人年龄上无统计学差异(P=0.74)。COPD吸烟组及吸烟对照组的吸烟指数无显著差异(P=0.10)。COPD吸烟组FEV1%与FEV1/FVC均显著低于吸烟对照组和非吸烟对照组(P<0.05,P<0.05)。吸烟对照组与非吸烟对照组的FEV,%、FEV1/FVC 无统计学差异(P=0.41,P=0.30)。1.2慢阻肺气道基底细胞TROP2表达上调:COPD吸烟组气道上皮TROP2呈强阳性表达(P<0.05,P<0.05)。免疫荧光双染结果显示,TROP2和Cytokeratin 5在气道基底部位重合染色,表明高表达的TROP2蛋白来源于慢阻肺患者气道基底细胞。1.3 TROP2表达水平与气流受限密切相关:气道基底细胞TROP2表达量与FEV1%呈负相关(r=-0.53,P<0.01)。1.4慢阻肺气道上皮ki67表达增多:免疫组化染色结果显示,慢阻肺患者气道上皮Ki67阳性染色细胞数明显增多。Ki67阳性细胞比率(%)在正常对照组、吸烟对照组和COPD吸烟组的表达逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05)。1.5 TROP2表达量和Ki67显著相关:在慢阻肺肺组织样本中,TROP2和Ki67阳性染色细胞比率(%)呈显著正相关,具有统计学意义(r=0.878,P<0.01)。2.TR0P2对基底细胞增殖的影响及机制研究2.1气道基底细胞鉴定:细胞免疫荧光染色显示,细胞同时表达基底细胞标志物Cytokeratin 5和p63(>95%),鉴定为气道基底细胞。2.2成功构建TROP2过表达及低表达基底细胞模型:TROP2基因转染基底细胞48小时后,转染组TROP2 mRNA表达量较对照组提高约4倍(P<0.05);蛋白表达量较对照组增高约2.5倍(P<0.05)。siRNA转染慢阻肺基底细胞48小时后,TROP2mRNA表达量较对照组降低约75%(P<0.05),蛋白表达量较对照组降低约60%(P<0.05)。2.3TROP2过表达促进细胞增殖及损伤修复:CCK-8结果表明,TROP2过表达的细胞增殖能力较对照组细胞明显增加(P<0.05)。流式细胞术检测TROP2过表达后细胞周期分布的改变,G1期细胞较对照组减少,进入S期细胞显著增多(P<0.05)。在划痕损伤后24和48小时,TROP2过表达基底细胞相对损伤面积明显低于对照组细胞(P<0.05)。2.4 TROP2基因沉默减弱基底细胞增殖及损伤修复:CCK8生长曲线结果显示,下调慢阻肺基底细胞TROP2表达后,增殖能力明显降低(P<0.05),细胞周期示S期比例降低(P<0.05);划痕24小时和48小时后,TROP2沉默组细胞修复能力显著减弱(P<0.05)。2.5 ERK/MAPK信号通路在TROP2促基底细胞增殖中发挥作用:TROP2基因转染48小时后,ERK蛋白的磷酸化增加,CyclinD1表达增多(P<0.05)。U0126预处理细胞后,TROP2诱导的ERK蛋白磷酸化显著降低,CyclinD1表达减少(P<0.05);CCK-8试验显示U0126预处理的pcDNA3.1-TROP2细胞增殖能力较未处理组降低(P<0.05),表明pERK1/2可能参与了 TROP2对基底细胞增殖的调控作用。3.TROP2促进气道基底细胞EMT样改变和炎症因子分泌3.1 慢阻肺气道基底细胞存在EMT现象:肺组织免疫荧光双染结果显示,部分Cytokeratin5+基底细胞有Vimentin阳性着色,慢阻肺基底细胞Vimentin染色阳性细胞比率较对照显著增多(P<0.05)。3.2 TROP2促进气道基底细胞EMT标志物表达:TROP2过表达组Vimentin表达较阴性对照和空白对照细胞明显增多,E-cadherin表达降低(P<0.05)。沉默慢阻肺基底细胞TROP2后,基底细胞E-cadherin表达增加,间质细胞标志物Vimentin表达减低,具有统计学差异(P<0.05)。3.3TROP2过表达促进基底细胞分泌炎症因子IL-6、IL-8、IL-1β:TROP2转染48小时,细胞上清液中IL-6、IL-8、IL-1 β较阴性对照显著增加(P均<0.05)。在三组细胞的TNF-a水平没有统计学差异(P>0.05)。3.4抑制炎症因子对TROP2促气道基底细胞EMT样改变无明显影响:使用中和抗体阻断IL-6、IL-8、IL-1β后,TROP2过表达基底细胞的E-cadherin和Vimentin表达较对照组无显著差异(P>0.05)。3.5抑制ERK1/2对TROP2促基底细胞EMT样改变和炎症因子分泌无显著影响:使用U0126预处理细胞,TROP2过表达后气道基底细胞EMT改变和炎症因子分泌均未受明显影响(P>0.05;P>0.05)。结论:1.TROP2在慢阻肺气道基底细胞中显著高表达,TROP2表达水平与气道上皮增生指数及肺功能气流阻塞程度显著正相关。2.体外细胞实验表明,TROP2过表达能够促进气道基底细胞增殖,这种作用可能通过ERK/MAPK信号途径实现。3.TROP2能够促进气道基底细胞发生EMT样改变,并促进炎症因子IL-6、IL-8和IL-1β释放,可能在慢阻肺气道重塑中发挥重要作用。