目的:慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)是一种以气流受限为特征的慢性气道炎症性疾病,香烟烟雾暴露是其主要病因之一,香烟通过诱导巨噬细胞损伤及功能异常参与到了慢阻肺的病理生理过程中。巨噬细胞具有异质性,可在外界环境刺激下分化为具有促炎功能的M1型和具有抗炎和免疫调理功能的M2型巨噬细胞,在慢阻肺患者气道内,巨噬细胞M1和M2极化分别对应着气道炎症和气道重塑。此外,香烟可通过诱导气道和肺泡上皮细胞凋亡,增加气道内凋亡细胞残骸累积进而诱导肺气肿病变。然而在既往研究中香烟对于巨噬细胞M1/M2极化以及凋亡的作用尚存有争议,且其分子机制仍有待探索。因此本研究将针对香烟对巨噬细胞M1/M2极化和凋亡的作用及其分子机制进行探索。本研究共分为三个部分,第一部分在体外试验中探索香烟烟雾提取物(CSE)对肺泡巨噬细胞(AM)和腹腔巨噬细胞(PM)M1/M2极化的动态调节作用;第二部分探索PPARγ在CSE诱导的AM极化过程中发挥的作用;第三部分探索CSE对巨噬细胞系Raw264.7凋亡的作用及其分子机制。研究方法:1第一部分:探索CSE对AM和PM极化的动态调节过程。1.1于6-8周龄雄性SD大鼠的支气管肺泡灌洗液和腹腔灌洗液中提取AM和PM;1.2参照既往文献的方法制备CSE,每次实验中使用的CSE均为新鲜制备;1.3向AM和PM的培养基中加入0.25%、0.5%、1%和2%浓度的CSE,培养6、12和24小时后,使用CCK8法检测细胞活性;1.4向AM和PM的培养基中加入0.5%、1%和2%浓度的CSE,培养3、6、9、12和24小时后,使用q PCR法检测M1/M2标记物i NOS、TNF-α、IL-1β、arg1、CD206和TGF-β的m RNA表达,同时于1%CSE作用12小时检测CCL17、IL-1rn、TNF-α、SPHK1、Mertk和VEGFα的m RNA表达以明确M2极化的亚型;1.5向AM和PM的培养基中加入0.5%、1%和2%浓度的CSE,培养12小时后,使用流式细胞术检测AM和PM的极化标记物CD86、CD163和CD206的蛋白表达;1.6使用i NOS与arg1的m RNA相对表达量比值来评估M1极化和M2极化的动态变化。2第二部分:探索PPARγ在CSE诱导的AM极化过程中的调控作用。2.1使用香烟烟雾被动暴露的方法建立大鼠肺气肿模型,使用平均肺泡内衬间隔和单位视野平均肺泡数评估模型建立情况;2.2通过流式细胞术检测其肺泡灌洗液中巨噬细胞极化标记物CD86和CD206阳性细胞率;2.3通过免疫组化检测肺泡巨噬细胞i NOS和CD206阳性细胞数,以评估模型鼠肺部巨噬细胞极化状态;2.4使用0.5%、1%和2%浓度的CSE培养大鼠AM12小时,通过蛋白免疫印迹法检测其PPARγ和RXRα的蛋白表达;2.5在加入CSE前使用梯度浓度的罗格列酮预处理细胞,使用q PCR法检测AM中i NOS、TNF-α、IL1-β、arg1和CD206的m RNA表达;2.6在加入CSE和罗格列酮前行GW9662和HX531预处理,以明确PPARγ和RXRα通路在其中的作用。3第三部分:探索CSE对巨噬细胞系Raw264.7凋亡的作用及分子机制。3.1使用CCK8法检测CSE对Raw264.7细胞活力的作用;3.2使用Annexin V/PI实验检测CSE对Raw264.7细胞凋亡的作用;3.3使用蛋白免疫印迹法检测cleaved caspase 3、cleaved PARP、Bcl2、Bax、CHOP、Bi P、P-P38、P-JNK、P-ERK1/2、P-STAT1等凋亡相关分子通路的蛋白表达;3.4使用DCFH-DA探针法检测细胞活性氧(ROS)水平;3.5使用Fluo-4 AM探针标记法检测细胞内钙离子水平;3.6在加入CSE前使用caspase、内质网应激(ERS)、MAPKs及STAT1抑制剂预处理Raw264.7细胞,使用上述方法检测细胞凋亡及相关分子通路蛋白的表达。结果:1第一部分:探索CSE对AM和PM极化的动态调节过程。1.1 CSE增加了AM和PM中i NOS、TNF-α、IL-1β的m RNA表达及CD86阳性细胞比例,促进M1极化,且随着作用时间和浓度的增加,M1极化持续增强;1.2 CSE降低了AM和PM中arg-1、CD206、TGF-β1的m RNA表达及CD206阳性细胞比例,抑制了M2极化;1.3 CSE作用9h-24h期间AM和PM中arg1表达逐渐增加,表现出M2极化激活的倾向;1.4 1%浓度的CSE作用12小时增加了AM和PM中SPHK1和VEGFα的m RNA表达,诱导了M2b和M2d极化激活;1.5 AM在CSE作用12h后出现了以M1极化优势向M2极化优势转变的趋势,PM在CSE作用24h内M1极化持续增强。2第二部分:探索PPARγ在CSE诱导的AM极化过程中的调控作用。2.1与对照组大鼠相比,熏烟大鼠肺部气肿明显,单位视野平均肺泡数增加而平均肺泡内衬间隔降低,提示肺气肿造模成功;2.2熏烟大鼠肺泡灌洗液中CD86阳性细胞率较对照组升高,CD206阳性细胞率无显著变化,熏烟大鼠肺组织石蜡切片中i NOS阳性细胞较对照组增加,CD206阳性细胞无显著变化,提示在体内实验中香烟暴露可诱导肺泡巨噬细胞M1极化激活;2.3在体外实验中CSE降低了AM中PPARγ和RXRα的蛋白表达;2.4 1%浓度CSE增加了AM中i NOS、TNF-α和IL-1β的m RNA表达,诱导M1极化,PPARγ激动剂罗格列酮预处理可降低上述M1极化标记物水平;2.5与CSE组相比,罗格列酮预处理提高了AM中PPARγ的蛋白表达,且其对AM极化的调节作用受到PPARγ特异性抑制剂GW9662的拮抗,提示罗格列酮通过激活PPARγ抑制了CSE诱导的肺泡巨噬细胞M1极化的过程;2.6与CSE组相比,罗格列酮预处理提高了AM中RXRα的蛋白表达,且其对AM极化的调节作用受到RXRα特异性抑制剂HX531的拮抗,提示罗格列酮通过激活RXRα抑制了CSE诱导的肺泡巨噬细胞M1极化的过程。3第三部分:探索CSE对巨噬细胞系Raw264.7凋亡的作用及分子机制。3.1 0.125%、0.25%、0.5%、1%的CSE作用于Raw264.7细胞8小时增加了细胞活性,而2%和4%的CSE降低了细胞活性;3.2 1%和2%的CSE作用于Raw264.7细胞8小时增加了凋亡细胞比率,同时CSE也增加了细胞内cleaved caspase3及cleaved PARP的蛋白表达,加入CSE前使用caspase抑制剂Z-VAD-FMK预处理细胞,其凋亡比率明显减少,提示CSE通过激活caspase3诱导了Raw264.7细胞的凋亡;3.3 CSE降低了Raw264.7细胞中Cytochrome-C蛋白表达和ROS水平,对Bcl2、Bax、caspase9的蛋白表达无显著影响,提示CSE对Raw264.7的凋亡独立于线粒体凋亡途径和氧化应激;3.4 CSE增加了Raw264.7细胞中内质网应激标记物CHOP、Bi P和P-eif2α的蛋白表达,内质网应激抑制剂4-PBA可减少CSE诱导内质网应激和细胞凋亡,提示CSE是通过激活内质网应激诱导Raw264.7细胞的凋亡;3.5 CSE增加了Raw264.7细胞中P-P38/P38、P-JNK/JNK和P-ERK/ERK的比值,激活了MAPKs,P38、JNK和ERK1/2的特异性抑制剂SB203580、SP600125和PD0325901可以分别抑制其磷酸化激活,其中只有P38抑制剂可以显著降低CSE诱导的凋亡比率和cleaved caspase3的蛋白表达,JNK抑制剂对细胞凋亡无显著影响,而ERK1/2抑制剂在CSE作用的基础上进一步增加了凋亡细胞比率;3.6 CSE增加了Raw264.7细胞中STAT1的Ser727位点磷酸化蛋白表达,减少了其Tyr701位点的磷酸化蛋白表达,STAT1的抑制剂Fludarabine可减少CSE诱导的细胞凋亡比率,P38抑制剂可以减少CSE诱导的STAT1(Ser727)磷酸化,提示CSE通过激活P38/STAT1诱导了Raw264.7的细胞凋亡;3.7 CSE增加了Raw264.7细胞内钙离子水平,钙离子螯合剂BAPTA可减少CSE诱导cleaved caspase3蛋白表达和细胞凋亡比率,同时也可以减少CSE诱导的P38和STAT1(Ser727)的磷酸化蛋白表达,提示CSE通过激活Ca2+/P38/STAT1诱导了Raw264.7的细胞凋亡。结论:1 CSE促进了巨噬细胞M1极化,对M2极化具有先抑制后促进的动态调节作用,AM对CSE诱导的极化改变较PM更为灵敏;2在体内实验和体外实验中,香烟均可诱导巨噬细胞M1极化激活,而PPARγ激动剂罗格列酮可以通过激活PPARγ/RXRα缓解CSE诱导的M1极化,促进M2极化激活;3 CSE通过激活了内质网应激和细胞内Ca2+/P38/STAT1通路,诱导了巨噬细胞系Raw264.7中caspase3依赖的凋亡,但是其凋亡过程独立于线粒体途径和ROS。