恶性肿瘤是严重危害人类健康的疾病。由于环境污染、职业接触、食品安全和生活习惯等因素的影响,我国恶性肿瘤的发病率显著上升。其中胃癌在我国的发病率位居第2位而死亡率位居第3位,胃癌五年生存率仅有20%。化疗是胃癌治疗的主要手段之一,顺铂则是胃癌化疗的常用药物。顺铂主要通过与DNA交联,诱导DNA双链损伤,从而导致细胞凋亡。顺铂对DNA合成迅速、细胞增殖活跃的肿瘤细胞有较好的杀灭效果,但肿瘤细胞也能够通过增强DNA修复能力,调整细胞凋亡信号格局产生对顺铂的耐药性,从而导致化疗失败。对顺铂耐药的肿瘤细胞同时也会对其他化疗药物产生交叉耐药性,如5-氟尿嘧啶、阿霉素、三氧化二砷等。究其原因是由于这些药物的激活依赖于p53凋亡途径,而当这些药物诱导的p53凋亡通路受阻时,细胞就会对其产生交叉耐受。因此,筛选与常规细胞毒性药物作用机制不相同的生物治疗药物并研究其毒作用机制,将为发展有效的顺铂耐药逆转策略提供科学依据。肿瘤坏死因子诱导的凋亡相关配体(TNF-related apoptosis-induced ligand,TRAIL)是肿瘤坏死因子超家族中的一员,它可以通过与凋亡受体的结合发挥诱导肿瘤细胞凋亡的作用,且大多数正常组织细胞能够抵抗TRAIL的凋亡作用。细胞内存在两种类型的TRAIL受体:死亡受体TRAIL-R1(DR4)和TRAIL-R2(DR5),它们含有由70个氨基酸组成的死亡结构域,当TRAIL与之结合后可激活Caspase信号通路,进而诱导产生强烈的细胞凋亡效应;诱骗受体TRAIL-R3(DcR1)和TRAIL-R4(DcR2),由于其胞内段缺乏死亡结构域,故当TRAIL与之结合后不能激活细胞凋亡信号通路。TRAIL可以选择性诱导肿瘤细胞发生凋亡,并且TRAIL诱导的细胞凋亡不依赖于p53所处的功能状态。因此,利用TRAIL进行肿瘤治疗具有广泛的临床应用前景。JWA基因属于环境应答基因。我们的前期研究结果发现,JWA在顺铂、As203(ATO,三氧化二砷)、VP16(依托泊苷)诱导的肿瘤细胞凋亡过程中均发挥着重要的作用。本课题组采用胃癌细胞BGC823,通过浓度梯度法诱导产生顺铂耐药细胞BGC823/DDP。通过对这对敏感和耐药细胞株进行药物敏感性筛查实验,发现BGC823/DDP细胞虽高度耐受顺铂诱导的细胞凋亡,但对TRAIL诱导的细胞凋亡比BGC823细胞更为敏感。并且,在同样通过浓度梯度法诱导SGC7901细胞产生的顺铂耐药细胞SGC7901/DDP中我们也观察到了顺铂耐药细胞株相比于顺铂敏感细胞株对TRAIL更为敏感的现象。我们选用BGC823和BGC823/DDP这对细胞株进行了进一步研究,初步探讨了这一现象发生的机制,证实了 JWA通过对DR4、Bcl-2和Mcl-1的差异性调节分别对顺铂和TRAIL诱导的细胞凋亡产生不同的影响。目的:研究JWA在TRAIL诱导的胃癌细胞凋亡过程中发挥的作用,以及探讨JWA差异性调节顺铂和TRAIL诱导的胃癌细胞凋亡的分子机制。方法:利用课题组已经构建成功的胃癌顺铂耐药细胞株,采用CCK-8、流式细胞仪检测细胞凋亡、Western blot等实验方法比较TRAIL对顺铂耐药细胞与顺铂敏感细胞的作用差异。通过Western blot实验寻找出影响敏感和耐药细胞对TRAIL敏感性的关键分子:JWA、DR4、Bcl-2和Mcl-1。进一步利用qRT-PCR、免疫共沉淀等实验方法分别从转录水平、泛素化降解途径探讨JWA如何负调控DR4。并通过Western blot实验检测JWA对Bcl-2和Mcl-1这两个抗凋亡分子的调控作用。从而揭示JWA差异性调节顺铂和TRAIL诱导胃癌细胞凋亡的分子机制。结果:1、胃癌顺铂耐药细胞株BGC823/DDP比胃癌顺铂敏感细胞株BGC823对TRAIL诱导的细胞凋亡更敏感。通过CCK-8、流式细胞仪检测细胞凋亡、Western blot实验我们证明了通过浓度梯度法构建的BGC823/DDP耐药细胞对顺铂和As203诱导的细胞凋亡存在交叉耐药,但在TRAIL的作用下耐药细胞BGC823/DDP的IC50值是86ng/ml,显著低于TRAIL作用于顺铂敏感细胞BGC823的IC50值242ng/ml。通过CCK-8、流式细胞仪检测细胞凋亡、Western blot实验我们同样证明了胃癌顺铂耐药细胞株SGC7901/DDP比胃癌顺铂敏感细胞株SGC7901对TRAIL诱导的细胞凋亡更敏感。2、胃癌顺铂耐药细胞BGC823/DDP中DR4表达上调,促进TRAIL诱导的细胞凋亡。Western blot实验结果显示耐药细胞中DR4表达显著增加。在BGC823细胞中转染flag-DR4表达质粒上调DR4表达可显著增加TRAIL诱导的细胞凋亡。在BGC823/DDP细胞中转染DR4 shRNA质粒抑制DR4表达可以显著减轻TRAIL诱导的细胞凋亡。3、JWA通过负调控DR4抑制TRAIL诱导的细胞凋亡。Western blot实验结果显示在胃癌顺铂耐药细胞BGC823/DDP和胃癌顺铂敏感细胞BGC823中JWA和DR4的表达水平均呈现出相反趋势。在BGC823细胞中转染JWA siRNA抑制JWA表达可以显著增加TRAIL诱导的细胞凋亡,同时观察到DR4表达上调。在BGC823/DDP细胞中转染flag-JWA升高JWA表达可以抑制TRAIL诱导的细胞凋亡,同时观察到DR4表达明显降低。4、JWA通过泛素—蛋白酶体途径负调控DR4表达。在BGC823/DDP细胞中转染flag-JWA升高JWA表达后用放线菌酮(CHX)分别处理0、2、4、6、8h,观察到升高JWA后的BGC823/DDP中的DR4蛋白降解速度明显加快。免疫共沉淀实验进一步证明JWA通过泛素—蛋白酶体途径负调控DR4表达。5、JWA通过负调控Bcl-2促进顺铂诱导的细胞凋亡,通过正调控Mcl-1抑制TRAIL诱导的细胞凋亡。Western blot实验结果显示胃癌顺铂耐药细胞BGC823/DDP中的Bcl-2表达相比于胃癌敏感细胞BGC823上调,而Mcl-1表达相对下调。在BGC823细胞中转染flag-JWA表达质粒上调JWA,观察到Bcl-2表达下调,Mcl-1表达无明显变化;再用顺铂处理的情况下,Bcl-2表达下调的同时顺铂诱导的凋亡增多;而再用TRAIL处理的情况下,Mcl-1表达被激活升高的同时TRAIL诱导的凋亡减轻。在BGC823细胞中转染JWA si-RNA抑制JWA表达,观察到Bcl-2表达上调,Mcl-1表达无明显变化;再用顺铂处理的情况下,Bcl-2表达上调的同时顺铂诱导的凋亡减轻;而再用TRAIL处理的情况下,Mcl-1表达被抑制的同时TRAIL诱导的凋亡增加。结论:本研究首次发现JWA通过泛素—蛋白酶体途径负调控DR4表达及在TRAIL的作用下JWA正调控Mcl-1,抑制TRAIL诱导的细胞凋亡。首次阐明在胃癌细胞中,JWA作为一个关键节点分子分别调控顺铂和TRAIL诱导的细胞凋亡。本研究成果提示JWA具有发展成为胃癌患者制定针对性治疗方案的分子标志物的潜在科学价值。