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研究目的和内容:多形性胶质母细胞瘤是一种常见的高度恶性的颅内原发性肿瘤。目前,临床对于恶性胶质瘤的治疗主要是手术结合放疗、化疗及其他综合治疗。多形性胶质母细胞瘤呈浸润性生长,手术很难完全切除,术后易复发,且对化疗和放疗往往具有抗性,因而其预后很差,病人的平均生存期一般不超过两年。替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)是一种DNA烷化剂,可使O6-甲基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(一种DNA修复蛋白)失活。O6-甲基鸟嘌呤在下一个DNA复制循环中无法配对正确的碱基对,子链DNA形成缺口,最终导致细胞凋亡。研究表明,替莫唑胺能够显著改善胶质瘤患者的预后,已成为胶质瘤化疗的一线药物。但是由于胶质瘤存在于颅内,药物需要穿透血脑屏障,以及现在抗癌药物的耐药性等不利因素,胶质瘤的治疗及预后并不是很理想。所以,进一步探讨胶质瘤的发病机制,找寻新的增强肿瘤化疗敏感性的方法,是十分迫切的。Micro RNAs是一类长度约为21-23个核苷酸的非编码单链RNA分子,它们在胶质瘤的癌变及发生发展过程中起到重要的调控作用。其主要是通过与靶基因的3’端非转录区域(3‘UTR)特异性结合。人类超过1/3的基因都可以被mi RNAs所靶定,这些mi RNAs在细胞凋亡、增殖、分化、生长和代谢中发挥着重要作用。Micro RNA-874(mi R-874)参与了人类许多的肿瘤调控过程。本课题组的前期实验研究也发现在人类胶质瘤细胞中mi R-874表达量降低,并且在体外胶质瘤细胞中过表达mi R-874能够抑制胶质瘤细胞的增殖并且促进凋亡。但是,调控mi R-874在胶质瘤内的表达是否能够促进胶质瘤的化疗增敏性,我们还不是很清楚。所以,在本实验中,我们着重研究上调mi R-874的表达,对于替莫唑胺(TMZ)在多形性胶质母细胞瘤化疗治疗中敏感性的影响,并从分子水平探讨其作用的机制。方法:1.细胞转染及转染效率的检测:首先培养胶质瘤细胞株U87和LN229,采用瞬时转染技术,利用lipofectamine 2000将mi R-874模拟体(mimics)转染至两种胶质瘤细胞内。用lipofectamine 2000将阴性对照序列scramble转染至两种胶质瘤细胞内。2.实验分组及药物处理:分为scramble,TMZ,mi R-874,mi R-874+TMZ治疗组。上调胶质瘤细胞中mi R-874的表达,6小时后更换新鲜完全培养基,同时给予不同剂量替莫唑胺进行作用,化疗24小时、48小时。3.利用MTT方法检测细胞增殖,Annexin V/PI流式染色检测细胞凋亡,JC-1流式染色检测线粒体膜电位变化情况,Transwell实验检测细胞的侵袭、迁移情况,Western blotting检测细胞STAT3、凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax以及迁移侵袭相关蛋白MMPs的表达情况。结果:1.转染mi R-874 mimics上调胶质瘤细胞中mi R-874的表达,给予替莫唑胺治疗24、48小时后,MTT结果显示相对于对照组,mi R-874联合TMZ治疗能够明显抑制胶质瘤细胞U87和LN229的增殖活性,差异显著具有统计学意义(P<0.05);2.Annexin V/PI及线粒体膜电位流式分析发现,相对于其他三组(scramble,TMZ,mi R-874),mi R-874联合TMZ治疗组的胶质瘤细胞凋亡最为明显,差异显著具有统计学意义(P<0.05);3.通过Transwell实验我们发现mi R-874联合TMZ组的胶质瘤细胞的迁移、侵袭能力明显受到抑制,与对照组差异显著具有统计学意义(P<0.05);4.Western Blotting结果显示,mi R-874联合TMZ组的p-STAT3/STAT3信号通路受到抑制,抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平降低,促凋亡蛋白Bax表达水平上调,迁移侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9的表达水平降低,差异显著具有统计学意义(P<0.05)。结论:MTT发现转染mi R-874能够明显增强TMZ抑制胶质瘤细胞生长活性的能力;Annexin V/PI及线粒体膜电位流式分析发现,mi R-874联合TMZ治疗可以显著增强替莫唑胺对恶性胶质瘤细胞的凋亡诱导作用,其机制可能与p-STAT3/STAT3信号通路受到明显抑制,Bcl-2表达降低,Bax表达上调,MMP-2、MMP-9表达降低有关;Transwell实验发现转染mi R-874能明显抑制胶质瘤细胞的迁移、侵袭能力。这些提示:恶性胶质瘤细胞中mi R-874过表达,通过调控p-STAT3/STAT3通路增强胶质瘤细胞对TMZ的化疗敏感性,两者在恶性胶质瘤化疗中有协同作用。通过阐明mi R-874在胶质瘤细胞化疗中的作用及其机制有助于对恶性肿瘤的耐药进一步深入的了解,同时也为肿瘤化疗治疗提供新的线索。