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生物色谱技术是对中药活性成分筛选,分离和结构鉴定同时进行的新技术。通过对已有生物色谱模型优缺点的分析,本论文提出在固定相表面,构建一层类细胞膜结构以制得仿细胞膜色谱固定相,建立一种快速高通量筛选药物新模型-仿细胞膜色谱法,以宁夏民族地道药材-苦豆子为例,阐明仿细胞膜色谱法在中药活性成分筛选中的应用。主要研究工作如下:
1.以三氯氧磷、氯化胆碱和甲基丙烯酸-2-羟乙酯(HEMA)为原料,合成了含磷酰胆碱基团的2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC),再将MPC嫁接聚合到活化硅胶表面,制得磷酰胆碱色谱固定相;将磷酰胆碱色谱柱作为两性离子交换色谱柱同时分离了2种酸性和2种碱性标准蛋白;研究了四类不同结构约物在磷酰胆碱色谱柱上的保留特性(lgkpcc),同时与磷脂膜色谱(immobilized artificial membrane chromatography,IAMC)柱、正辛醇/水系统进行了比
较,结果表明,lgkpcc与lgkIAM、lgDO/B.7.4分别具有明显的相关性,说明用磷酰胆碱层模拟细胞膜磷脂层与药物的相互作刚是合理的。
2.刚柱层析法从大豆磷脂中纯化出脑磷脂,将脑磷脂固定于醛基改性后的硅胶上并自组装成双层膜,得到脑磷脂双层膜色谱固定相,用于预测四类不同化学结构药物的膜渗透性。
3.用离心法得到支气管细胞膜,并将它吸附于酸活化后的硅胶表面,制得支气管细胞膜色谱固定相。测定了已知受体药物在支气管细胞膜色谱柱上的保留特性,结果表明,已知受体药物中,β2-肾上腺素受体激动剂与阻断剂有保留行为,但拖尾现象严重,无法用于苦豆子活性成分的筛选。
4.用亲和层析法纯化得β2-肾上腺素受体,并将其固定于含环氧基团的磷酰胆碱色谱固定相上,制得仿细胞膜色谱固定相。刚前沿色谱法测定了硫酸沙丁胺醇、重酒石酸去甲肾上腺素和盐酸普萘洛尔与β2-AR的结合常数。结果表明,仿细胞膜色谱固定相上的β2-AR与药物的结合常数顺序与文献报道一致,说明β2-AR经过纯化,固定化,装柱等操作后,依然保持其原有的活性。
5.将制备的仿细胞膜色谱固定相应用于苦豆子活性成分的筛选。结果表明,仿细胞膜色谱柱筛选出了苦豆子中与β2-AR作刚的活性成分,说明该色谱法为中药有效成分的筛选提供了一种新的技术与方法。