目的　　通过原核表达TAT-Ag85B融合蛋白，与T-bet基因佐剂配伍构建新型抗结核病复合疫苗，评价新型疫苗的免疫原性及抗结核感染的保护作用，探究新型复合疫苗增强免疫应答的机制，为新型结核疫苗的研发提供新的思路和理论基础。　　方法　　1.根据GenBank报道的目的基因(Ag85B和TAT-PTD基因)全长序列，构建pET-28a-TAT-Ag85B和pET-28a-Ag85B重组质粒，经菌液PCR、质粒双酶切及测序鉴定。　　2.将含有pET28a-TAT-Ag85B和pET-28a-Ag85B质粒的重组大肠杆菌经IPTG诱导、镍离子亲和层析纯化Ag85B、TAT-Ag85B蛋白，用Western blot法鉴定纯化后的蛋白。　　3.将Ag85B、TAT-Ag85B蛋白和本实验室保存的pcDNA3.1-T-bet质粒免疫BALB/c小鼠，末次免疫结束后用ELISA法检测小鼠血清中抗Ag85B抗体滴度。同时将小鼠脾脏淋巴细胞于Ag85B或TAT-Ag85B刺激下培养，ELISA法检测培养液中细胞因子分泌情况。　　4.将各组末次免疫结束后的小鼠经尾静脉注射感染结核分枝杆菌标准株H37Rv，在感染后第一、二、四、八周检测小鼠肺和脾内结核菌载量并在感染后八周取肺脏做组织病理切片。　　5.用Ag85B、TAT-Ag85B蛋白分别刺激小鼠腹腔巨噬细胞，免疫荧光观察巨噬细胞内Ag85B蛋白的分布，Western blot检测细胞内Ag85B蛋白的含量，流式细胞术检测巨噬细胞表面分子CD80/CD86的表达。　　结果　　1.成功构建pET-28a-TAT-Ag85B和pET-28a-Ag85B质粒，PCR鉴定、质粒双酶切鉴定和测序鉴定结果正确。　　2.含有pET28a-TAT-Ag85B和pET-28a-Ag85B质粒的大肠杆菌经诱导、表达、纯化得到重组Ag85B、TAT-Ag85B蛋白，经Western blot鉴定为所需目的蛋白。　　3.使用ELISA方法检测各组免疫小鼠血清中抗Ag85B抗体滴度情况，发现总IgG抗体效价中，TAT-Ag85B/T-bet组最高，高于其他实验组;TAT-Ag85B/T-bet与TAT-Ag85B、Ag85B组相比IgG2a抗体滴度明显增高(P＜0.05)，IgG1滴度明显降低(P＜0.05);从脾细胞分泌细胞因子水平来看，TAT-Ag85B/T-bet组小鼠IFN-γ/IL-2水平显著升高(P＜0.05)，IL-4/IL-10水平低于Ag85B和TAT-Ag85B组(P＜0.05)。　　4.H37Rv感染各组小鼠后，在第1周和第2周，各组小鼠的肺组织和脾组织结核菌载量无明显差异，在第4周TAT-Ag85B/T-bet组小鼠肺组织和脾组织结核菌载量明显低于PBS对照组(P＜0.05)，在第8周时，TAT-Ag85B/T-bet、脾和肺组织结核菌载量低于对照组，有显著性差异(P＜0.05);从肺组织大体外观判断，与对照组小鼠肺部外侧明显的结核灶分布相比，TAT-Ag85B/T-bet免疫组肺部外观几乎无肉眼可见结核结节;HE染色发现TAT-Agg5B/T-bet免疫组小鼠的肺组织中病变明显减轻，少量的充血、坏死和实变，有少量不明显的肉芽肿结节形成;抗酸染色结果显示在TAT-Ag85B/T-bet免疫的小鼠的肺组织中结核杆菌呈零星散在分布，无簇状或片状分布。　　5.与Ag85B刺激巨噬细胞相比，TAT-Ag85B蛋白大量散在分布于巨噬细胞内，经TAT-Ag85B蛋白刺激后的巨噬细胞表面抗原提呈分子CD80/CD86表达荧光强度高于Ag85B蛋白。　　结论　　本研究初步阐明TAT-Ag85B蛋白疫苗辅以T-bet基因佐剂可以引起小鼠体内强烈的特异性免疫应答，并且以Th1优势免疫应答为主，对小鼠有一定的抗结核保护作用;TAT-Ag85B蛋白的跨膜转运功能可能在提高巨噬细胞抗原提呈能力中起重要作用，并参与了增强的抗结核免疫应答;T-bet佐剂对Th1优势免疫的诱导具有重要作用。总之，该复合型疫苗的研究将为新型结核疫苗的研发提供新的思路和理论基础。