目的：近30年来，随着细胞生物学、分子生物学及生物工程技术的迅猛发展，生物免疫治疗已成为继手术、放疗、化疗后抗肿瘤治疗的第四大模式，为癌症的治疗开辟了新的途径，它克服了各种常规疗法的治疗缺陷，大幅提高癌症治疗疗效，对延长患者生存期有着非常重要的作用。过继性细胞免疫治疗（Adoptive Cell immunotherapy，ACT）是生物免疫疗法的一种，指把自体或异体的免疫细胞分离至体外，大量培养、激活、扩增到一定数量后再输注到病人体内，从而增强病人抗肿瘤的能力。其中细胞毒性T细胞（Cytotoxic T Lymphocyte,CTLs）是机体清除病毒感染细胞和癌变细胞的主要效应细胞，它的活化依赖于抗原提呈细胞（Antigen-presenting cell,APC)传递的抗原信息和共刺激分子的刺激，而树突状细胞（Dendritic cells,DCs)是当前公认的抗原提呈能力最强的APC，将肿瘤相关抗原组合负载到成熟的DC中，与初始T细胞共培养后，能诱导产生肿瘤特异性T细胞，即CTL。但是DC数量非常少，只占外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMCs）1%以下，经体外培养得到成熟的DC数量更少，质量也不稳定，且DC细胞难以扩增，经诱导产生的特异性T细胞数量较少，远远不足临床治疗的要求。肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor-infiltrating lymphocytes,TILs)是指从肿瘤组织中分离出的免疫细胞，具有特异性高、杀伤作用强等特点，但是用常规方法（如加IL-2）诱导，扩增的数量有限。CTL和TIL都是目前杀伤功能最强的特异性T细胞之一，但都存在体外培养扩增数量不足的问题。为了解决这个难题，本课题通过模拟APC的功能--T细胞活化的双重信号途径，以滋养细胞K562为细胞载体制备人工抗原提呈细胞（artificial antigen-presenting cell，aAPC)，研究其对特异性T细胞的高效扩增作用。
　　方法：1.制备人工抗原提呈细胞：首先构建携带CD3抗体、CD28抗体、CD137抗体、膜分子IL-15基因片段的质粒，利用酶切进行初步鉴定，然后电转K562细胞，通过有限稀释法挑选单克隆，进行PCR鉴定，选择鉴定正确的克隆大量培养保种，制备得到人工抗原提呈细胞，命名为SH3857（K562/anti-CD3/anti-CD28/anti-CD137/IL-15)，再进行流式表型鉴定。
　　2.大量扩增特异性T细胞：扩增CTL--从患者外周血分离的单核细胞PBMCs贴壁培养，悬液中细胞即为初始T淋巴细胞，冻存起来备用，贴壁细胞通过加入细胞因子IL-4、GM-CSF、成熟因子polyI：C、IFN-γ的刺激培养诱导分化出DC，再用携带多抗原基因的腺病毒负载DC，d8产生成熟的DC细胞，与初始T细胞共培养后诱导产生一定量CTL。d12收集共培养后的T细胞，用荧光染料CFSE进行标记，分为实验组和对照组，按与T细胞1∶40的比例分别加入γ线照射过的人工抗原提呈细胞SH3857、K562细胞刺激培养，记为d0，在d2、d4、d6、d8、d10、d12分别补加SH3857和等量的K562细胞。通过细胞计数和CFSE的流荧光式检测了解细胞增殖的情况。d12收集适量实验组悬浮细胞，流式检测活化T细胞表型、记忆T细胞表型、IFN-γ。扩增TIL--从手术标本分离的TIL同样用CFSE染色，分别加入γ射线照射过的SH3857、K562进行刺激培养，隔天补加SH3857、等量的K562。流式荧光检测CFSE对比TIL细胞增殖的情况。
　　结果：1.酶切初步鉴定结果与PCR鉴定结果均正确，流式检测细胞表型结果显示人工APC的anti-CD3、anti-CD28基本100%表达，表明成功构建了人工抗原提呈细胞（SH3857）。
　　2.细胞计数发现实验组的特异性T细胞从第2天开始增殖，第6天进入快速增长期，第10-12天增殖速度达到最快，最多能扩增约55倍；而对照组的T细胞则进入平台期，逐渐凋亡。流式荧光检测CFSE结果显示，实验组（加SH3857）T细胞的荧光强度明显弱于对照组（加K562），实验组T细胞增殖能力明显更强。经SH3857刺激扩增后T细胞高表达活化标志，CD137∶86.5%，CD28∶99.6%，PD-1∶82.8%，活化T细胞占有较大比例，分泌IFN-γ阳性的特异性T细胞占有一定比例（34.9%）。流式检测记忆T细胞标志CD45RO（99.1%），CCR7和CD62L检测结果发现存在一定量中心记忆T细胞。
　　结论：成功构建了工抗原提呈细胞SH3857，SH3857能高效扩增特异性T细（CTL/TIL)，经SH3857刺激扩增后的活化T细胞仍具有较强杀伤肿瘤的能力，具有较好的应用前景。