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第一部分 钠氢交换体1对糖尿病db/db小鼠心脏钙蛋白酶和糖原合成酶激酶-3β的调节作用目的探讨钠氢交换体1(NHE1)抑制剂卡立泊来德(CAR)对db/db糖尿病小鼠心脏钙蛋白酶(Calpain)、骨桥蛋白(OPN)和糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)蛋白的影响。方法选取7周龄雄性C57BL/KS db/db小鼠和C57BL/KS野生型(WT)小鼠各16只,采用随机数字表法分为4组:对照组(WT)、CAR组(WT+CAR)、模型组(db/db)和CAR干预组(db/db+CAR)。10周后行血流动力学检查并处死取血和心脏标本,生化法测定血糖(FPG)、甘油三酯(TG)和胆固醇(TC);酶联免疫吸附法测定胰岛素水平,计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);HE染色观察心肌病理改变,测定心肌组织辅酶Ⅱ/还原型辅酶Ⅱ(NADP+/NADPH)比率、硝基酪氨酸(NT)、3-硝基酪氨酸(3-NT)和4-羟基壬烯酸(4-HNE)的含量;荧光定量PCR测定心肌组织NADPH氧化酶p22phox、p91phox亚基、转化生长因子-β1(TGF-β1)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)和骨桥蛋白(OPN)的mRNA水平。酶联免疫吸附剂测定(ELISA)测定心肌组织肿瘤坏死因子(TNF-α)和白介素IL-1β(IL-1β)的含量。采用Western blot检测心肌组织OPN、Calpain-1、Calpain-2、钙调磷酸酶(CaN)、蛋白激酶B(AKT)和GSK-3β蛋白的表达;采用试剂盒检测心肌Calpain和CaN酶的活性。两两比较采用t检验,组间比较采用单因素方差分析。结果(1)与WT组比较,db/db组FPG、TC、TG和HOMA-IR明显升高,均有统计学差异(分别为 5.78± 1.14 比21.21 ±4.12,2.29±0.52 比4.28±0.74,0.86±0.36比 1.65±0.19,0.65±0.18 比 23.75±9.39,t=10.35,6.228,5.428,6.957,均 P<0.05);与db/db组比较,CAR+db/db组小鼠FPG、TC、TG和HOMA-IR有下降趋势(t=2.111,2.112,1.213,1.651,P>0.05)。(2)光镜下WT组小鼠心肌细胞排列整齐,db/db组小鼠心肌组织出现明显的心肌纤维排列不规则和心肌细胞肥大,CAR+db/db组小鼠心肌损伤情况明显改善。(3)与WT组小鼠相比,db/db组小鼠LVEDP升高,±dp/dtmax的绝对值减少(t=9.973,8.929,7.174,P<0.05)。与db/db组比较,CAR+db/db组小鼠±dp/dtmax绝对值增大,LVEDP下降,两组比较有统计学差异(t=6.404,2.865,4.531,P<0.05)。提示CAR明显减轻心肌组织病理损伤及明显改善小鼠心脏血流动力学。(4)与WT组比较,db/db小鼠心肌组织中NADP+/NADPH的比值、p22phox、gp91phox 的 mRNA 水平及 NT、3-NT、4-HNE 的含量均明显上升(t=6.988,3.953,3.901,8.088,10.89,5.375,P<0.05);与 db/db 组比较,CAR 干预能明显改善db/db小鼠心脏组织中氧化/硝化应激,两组间比较有统计学差异(t=4.845,2.519,2.565,2.803,4.131,2.581,P<0.05)。(5)与WT组小鼠比较,CAR对WT小鼠心脏组织中TNF-α和IL-1β的含量无明显影响(t=0.345,0.409,P>0.05);而db/db小鼠心肌组织中TNF-α和IL-1β 的含量均明显上升(t=8.608,9.950,P<0.05);与 db/db 组比较,CAR+db/db组明显改善db/db小鼠心脏组织中TNF-α和IL-1 β水平,两组相比较有统计学差异(t=2.682,2.804,P<0.05)。(6)与WT组比较,db/db组心肌胶原含量、TGF-β 1和MMP-2 mRNA水平明显增加,MMP-9 mRNA水平明显下降,与db/db组比较,CAR+db/db组小鼠心肌组织胶原含量、TGF-β 1、MMP-2和MMP-9mRNA水平(t=2.914,2.925,2.491,2.732,P<0.05)。(7)与WT组比较,db/db糖尿病小鼠心肌组织OPN蛋白和mRNA表达明显上调,但NHE1抑制剂CAR能明显抑制心脏组织OPN蛋白和mRNA表达。NHE1抑制剂CAR对WT小鼠心肌组织中NHE1抑制剂CAR无明显影响。(8)与WT组比较,db/db小鼠心肌组织中Calpain、CaN酶活性明显增加(t=3.70,9.738,P<0.05),Calpain-1、Calpain-2、CaN 蛋白含量明显增加(t=3.492,3.353,3.871,P<0.05)。与 db/db 组比较,CAR 能降低 db/db 小鼠心肌 Calpain、CaN 酶活性和其蛋白含量(t=2.935,2.792,2.634,3.253,2.887,P<0.05)。(9)与WT组比较,db/db小鼠心肌组织中AKT和GSK-3β蛋白无明显变化,但是p-AKT和p-GSK-3β蛋白表达明显下降(t=6.183,6.400,P<0.05)。与db/db组比较,CAR还能上调p-AKT和p-GSK-3β蛋白表达(t=2.827,4.090,P<0.05)。结论CAR能改善db/db小鼠心脏损伤,其机制可能与CAR改善高糖高脂和胰岛素抵抗,抗氧化应激能力及调节Calpain和AKT/GSK-3β蛋白有关。第二部分 钠氢交换体1在高糖诱导乳鼠心肌细胞损伤中的作用研究目的本研究通过建立Sprague-Dawley(S-D)大鼠乳鼠心肌细胞高糖损伤模型,观察钠氢交换体1(NHE1)抑制剂卡立泊来德(CAR)对高糖诱导乳鼠心肌细胞损伤是否具有保护作用,并探讨其可能的作用机制。方法通过体外原代培养0-3d乳鼠心肌细胞,不同浓度CAR(0-1000μmol/L)干预心肌细胞,确立CAR安全范围浓度,然后选择安全范围浓度CAR(5-80μmol/L)干预高糖环境下心肌细胞,运用CCK8法测定细胞活力,确立CAR最佳治疗浓度。采用生化试剂盒检测心肌细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)的活性、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量。酶联免疫吸附剂测定(ELISA)测定心肌组织肿瘤坏死因子(TNF-α)和白介素IL-1β(IL-1β)的含量。采用试剂盒检测心肌Calpain和CaN酶的活性。流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测心肌细胞凋亡;Western blot方法测定Bcl-2、Bax、Caspase-33和GSK-3β蛋白表达的变化。结果(1)对CAR进行浓度梯度筛选,发现20μmol/L的CAR可以有效保护心肌细胞对抗高糖损伤。(2)与Control比较,高糖环境培养心肌细胞培养液中SOD活性降低,MDA、TNF-α、IL-6 含量明显升高(t=3.931,3.928,4.069,6.148,P<0.05);CAR对正常糖环境下培养心肌细胞SOD活性、MDA、TNF-α、IL-1β含量无明显影响(t=0.579,0.496,0.686,0.411,P>0.05)。与 HG 组比较,CAR 能明显升高高糖环境培养心肌细胞培养液中SOD活性,降低MDA、TNF-α、IL-6含量两者比较有统计学差异(t=2.268,2.435,2.561,3.257,P<0.05)。(3)正常培养液培养的心肌细胞凋亡率很低,高糖诱导24h后的心肌细胞凋亡率明显上升(P<0.05)。给予20μmol/LCAR后,细胞凋亡率明显降低,与HG组比较,统计学有显著性差异(P<0.05)。提示,20μmol/LCAR可以有效对抗高糖损伤,减少高糖诱导心肌细胞的凋亡。(4)Western bolt结果显示,高糖损伤可以诱导心肌细胞内促凋亡蛋白Bax表达增多,同时抗凋亡蛋白Bcl-2的表达减少。20μmol/LCAR可以有效上调Bcl-2、下调Bax,从而对抗高糖损伤,抑制心肌细胞的凋亡。(5)高糖损伤可以诱导心肌细胞内Cleaved-Caspase-3蛋白表达增多,Caspase-3活性明显升高(t=8.735,P<0.05)。20μmol/LCAR可以有效减少Cleaved-Caspase-3 蛋白表达和 Caspase-3 活性(t=2.326,P<0.05)。(6)与Control组比较,HG组心肌细胞GSK-3β蛋白无明显变化,但是p-GSK-3β蛋白表达明显下降(P<0.05):与HG组相比,CAR能明显升高高糖环境培养心肌细胞pGSK-3β蛋白表达(P<0.05)。(7)与Control比较,高糖环境培养心肌细胞Calpain和CaN酶活性明显增加(t=10.13,9.126,P<0.05),CAR对正常糖环境下培养心肌细胞无明显影响(t=1.087,0.489,P>0.05)。与HG组比较,CAR能明显降低高糖环境培养心肌细胞Calpain和CaN酶活性,两者比较有统计学差异(t=2.588,2.675,P<0.05)。结论:高糖损伤可以增加心肌细胞上清液中LDH的水平,增加氧化应激和炎症因子的释放,促进细胞凋亡。CAR可以有效拮抗高糖损伤,减少受损细胞内LDH的释放,同时拮抗氧化应激和炎症因子的释放,减少凋亡。其机制可能与CAR上调Bcl-2与下调Bax的表达有关,GSK-3β和Calpain在其中也发挥重要的作用。