本文主要内容如下：　　 一、研究背景：　　 内毒素性休克临床特征表现为严重的毒血症，伴低血压和器官低灌注，且对液体复苏反应欠佳，是ICU中致死的最常见病因之一，死亡率高达20%～80%，仅在美国每年超过10万名患者死于该症。　　 DC属固有免疫细胞，其通过摄取抗原、分泌促炎性因子等参与固有免疫应答。同时，DC作为体内最重要的抗原提呈细胞，也是介导适应性免疫应答的关键细胞，其机制为：①加工、处理、提呈外源性抗原，提供T细胞活化的第一信号；②激活的DC高表达共刺激分子，提供T细胞活化所需的第二信号；③产生多种细胞因子，辅助淋巴细胞活化。因而，以DC为代表的APC被认为是连接固有免疫和适应性免疫的桥梁。　　 本研究建立诱导性Jak2基因敲除小鼠模型，并获如下发现：①Jak2基因缺陷可抑制DC的固有免疫功能，表现为发育受阻，低表达MHC 分子和共刺激分子，且在LPS 刺激下分泌细胞因子的能力下降；②Jak2基因缺陷并不影响DC介导适应性免疫应答的能力；③Jak2基因敲除小鼠对LPS所致的内毒素性休克有很强抵抗作用。　　 二、诱导性Jak2基因敲除小鼠模型的建立及功能分析：　　 1.Cre+/+Jak2fl/fl小鼠模型建立　　 本文用Jak2 fl/fl小鼠和他莫昔芬诱导性Cre转基因小鼠进行杂交，成功复制诱导性Jak2基因敲除小鼠模型。对8 周龄雄性Cre+/+Jak2 fl/fl小鼠腹腔注射他莫昔芬（1.0mg/40g 体重）/次，每天一次，连续5天，注射溶剂的同窝雄性小鼠作为对照。最后一次注射2 周后处死小鼠，培养BMDC和脾细胞，提取蛋白，借助Western blot分析Jak2表达，以验证基因敲除效果。结果显示；对照小鼠BMDC高表达Jak2，而他莫昔芬诱导的小鼠DC中未检出Jak2，脾细胞也获类似结果，表明在他莫昔芬诱导后，Cre+/+Jak2 fl/fl小鼠Jak2表达缺失。　　 2.Jak2基因敲除小鼠DC功能的改变：　　 (1)Jak2基因缺陷抑制DC发育：采集Ja k2-/-小鼠和对照小鼠骨髓细胞，用GM-CSF和IL-4诱导分化为BMDC。结果证实：①Jak2基因缺陷组BMDC数量降低1.3 倍；②Jak2基因缺陷组脾细胞总数明显降低，脾脏DC数量及在脾细胞中所占比例均降低；③Jak2基因缺陷组CD4+和CD8+T细胞百分比未见明显变化。上述结果表明：Jak2 功能缺陷可明显影响DC发育。　　 (2)Jak2基因缺陷抑制DC成熟和分泌细胞因子：培养第9天取部分DC，用LPS刺激24小时，于第10天收集DC，流式细胞术分析表型。　　 结果显示：①Jak2基因敲除组和对照组DC纯度均大于85%；②Jak2基因敲除组BMDC表面MHC II 类分子和共刺激分子表达均明显下降；③对单个脾DC检测，所得结果与BMDC相似；④Jak2基因敲除组巨噬细胞表型改变类似于DC。上述结果提示：Jak2基因缺陷可抑制DC成熟。　　 进一步检测Jak2缺陷对DC功能的影响。采集BMDC培养上清，借助ELISA检测相关细胞因子分泌：①LPS刺激前，Jak2-/-和对照BMDC上清中均未能检出IL-2、IL-6、IL-10和IL-12，Jak2-/-组可检出低水平TNF-α；②LPS 刺激后，对照检查组BMDC分泌大量促炎性细胞因子，而Jak2-/-BMDC所分泌相应细胞因子水平明显低于对照组；③LPS刺激后，Jak2-/-和野生型BMDC均未检出IL-2和IL-10。述结果显示：Jak2基因缺陷可明显抑制DC分泌炎性细胞因子。　　 (3)Jak2缺陷不影响DC启动适应性免疫应答：借助同种异体混合淋巴细胞培养检测DC刺激T细胞增殖的能力。经射线照射的Jak2-/-和野生型BMDC与BALB/c小鼠T细胞共培养，用3 H标记的胸腺嘧啶掺入实验检测T细胞增殖。　　 结果发现：Jak2-/-DC能刺激T细胞分泌IFN-γ、IL-10和IL-17，其分泌水平与野生型DC刺激T细胞分泌的水平无显著差异。上述结果显示，Jak2缺陷仅选择性抑制DC的固有免疫功能，但不影响DC介导适应性免疫应答的功能。　　 三、Jak2缺陷对致死性内毒素性休克的保护作用：　　 内毒素性休克属经典的炎性疾病，固有免疫异常在发病中起关键性作用。为探讨Jak2 调控固有免疫的效应，本文复制内毒素性休克模型，方法为：给予他莫昔芬4 周，注射致死剂量LPS 至Jak2基因敲除和野生型小鼠腹腔内。LPS 注射数小时后发现野生型小鼠的一般状态明显比Jak2基因敲除小鼠差，表现为发抖，蜷缩于鼠笼一角。两组小鼠内毒素性休克存活率分别为22%和85%。　　 四、Jak2调控DC功能的相关信号通路：　　 1.Jak2缺失抑制STAT4、STAT45、STAT46活化　　 Jak2可激活众多STAT 分子而启动不同下游效应。本文用LPS刺激Jak2缺陷型和野生型BMDC，30 分钟后用100μl 裂解液RIPA裂解BMDC，借助Western blot 技术检测下游信号分子的活化。结果显示：Jak2缺陷型BMDC裂解产物中，STAT4、STAT5和STAT6 磷酸化水平降低，而STAT1活化水平无明显改变，裂解液中未检出活化形式的STAT3。　　 鉴于NF-κB是LPS的主要信号通路，我们检测两组DC在LPS 刺激后的磷酸化IκB-α及NF-κB 水平。结果发现：LPS刺激30分钟后，两组间磷酸化的IκB-α和总NF-κB水平无明显差异。　　 2.Jak2-STAT5 通路促进DC发育和成熟　　 应用STAT5转基因小鼠模型探讨STAT5信号通路参与固有免疫应答的效应：①分离STAT5转基因小鼠脾脏细胞和骨髓细胞，诱导BMDC生成，Western检测发现转基因小鼠STAT5表达明显高于对照小鼠；②STAT5转基因阳性小鼠脾脏细胞数量明显高于转基因阴性的同窝对照小鼠和野生型对照小鼠；③流式细胞术检测发现，STAT5 过表达小鼠脾脏细胞中DC比例上调；④应用GM-CSF和IL-4诱导STAT5转基因小鼠和对照小鼠骨髓细胞分化为DC，STAT5 过表达可增加BMDC数量；⑤在刺激或未刺激条件下，STAT5 过表达BMDC中MHC II阳性细胞群、CD80 阳性细胞群、CD86 阳性细胞群和CD54 阳性细胞群比例均显著上调；⑥LPS 刺激前后，STAT5转基因BMDC分泌TNF-α和IL-6 水平与对照BMDC无显著区别；⑦LPS 刺激后，STAT5 过表达BMDC分泌IL-12 水平比对照BMDC明显升高。上述结果表明，Jak2 功能丧失可通过下调STAT5 而抑制DC发育、成熟。　　 3.Jak2-STAT6通路调节DC分泌炎性细胞因子　　 鉴于STAT5 仅影响DC分泌IL-12，提示可能存在其他通路影响LPS 刺激后DC分泌炎性细胞因子。采集STAT4基因敲除小鼠、STAT6基因敲除小鼠和野生型对照小鼠骨髓细胞，诱导生成BMDC，第9天用LPS 刺激BMDC，24 小时后采集培养上清，ELISA检测促炎性细胞因子分泌，结果发现：　　 (1)未受LPS 刺激，STAT6-/-BMDC分泌IL-6和TNF-α水平明显高于野生型对照组；各组BMDC均未检出IL-12。由此提示：STAT6基因缺陷可降低BMDC对LPS的反应性。　　 (2)LPS 刺激24 小时后，STAT6-/-BMDC分泌TNF-α和IL-12 均明显低于对照组，IL-6 水平与对照组无明显差异。考虑到刺激前基础分泌水平，LPS 刺激促进DC分泌炎性因子的效应在STAT6 缺陷组明显低于其他组。LPS 刺激后，野生型BMDC分泌IL-6和TNF-α水平分别升高40 倍和244 倍，而STAT6 缺陷BMDC仅分别升高6.5和12.9 倍。　　 (3)STAT4基因缺陷并不影响DC分泌炎性因子，LPS 刺激后，STAT4-/-BMDC分泌TNF-α升高倍数低于对照BMDC。　　 LPS 刺激后，TAT4-/-BMDC分泌3种炎性细胞因子的水平与野生型对照无明显差异。以上结果提示：Jak2 缺失可通过STAT6 途径而影响DC分泌炎性细胞因子。　　 五、结论：　　 1.Jak2基因敲除可抑制DC发育、成熟和分泌细胞因子。　　 2.Jak2基因缺陷不影响DC引发适应性免疫应答的功能。　　 3.Jak2基因敲除小鼠对致死剂量LPS所致内毒素性休克有抵抗作用，此效应与抑制DC分泌炎性因子相关。　　 4.Jak2 缺陷可影响STAT4、5、6活化；Jak2/STAT5信号通路参与调控DC发育、成熟；Jak2/STAT6通路参与调控DC分泌细胞因子。　　 综上所述，Jak2通过STAT5 途径调节DC发育和成熟，通过STAT6信号通路调控促炎性细胞因子分泌。DC的Jak2信号缺失可抑制其固有免疫功能，但不影响DC参与适应性免疫应答的功能。提示阻断DC的Jak2信号通路可能作为临床干预内毒素性休克的靶标。