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目的:1.鉴定HC6R1的特异性及其识别位点;2.研究HC6R1对肝细胞肝癌的抗瘤作用及其机制。方法:用人肝癌组织免疫小鼠,通过杂交瘤技术制备抗体。采用流式细胞术和免疫组化检测HC6R1是否能够特异性识别肝癌细胞和组织。通过免疫共沉淀及质谱分析鉴定HC6R1的识别位点。构建载体转染细胞使得IL6R基因沉默,以HC6R1和anti-IL6R作为一抗,通过Western blotting和流式细胞术进一步证明其识别位点。利用一系列的体外实验如CCK8、划痕实验、粘附实验和Transwell分别检测HC6R1对肝癌细胞的增殖、迁移、粘附和侵袭能力的影响;通过皮下注射HepG2和Huh7细胞建立肿瘤模型研究HC6R1对体内肿瘤的抑制作用。采用Annexin V/PI双染和流式细胞术检测HC6R1对肝癌细胞凋亡和细胞周期的影响。利用基因芯片技术检测HC6R1作用的靶基因。以STAT3、p-STAT3、CyclinD1和CDK4抗体作为一抗,用Western blotting检测其靶向基因的蛋白质表达水平。结果:1.HC6R1的制备和鉴定1.1利用杂交瘤技术制备并筛选出一种阳性单克隆抗体即HC6R1。1.2对人肝癌细胞系/肝癌组织和其他细胞/组织进行流式细胞术和免疫组化检测发现:HC6R1可以被人肝癌细胞和肝癌组织识别,而在正常肝脏细胞和癌旁组织中几乎检测不到HC6R1。1.3通过免疫共沉淀及质谱分析发现HC6R1抗体识别的抗原可能是IL6R。采用Western blotting和流式细胞术检测发现肝癌细胞内IL6R基因敲低后,HC6R1抗原和anti-IL6R的表达量均明显减少,进一步证实其识别的抗原为肝癌细胞的IL6R。2.HC6R1对肝癌的抗瘤作用及其机制研究2.1 CCK8检测发现HC6R1处理组细胞的增殖速度明显慢于mIgG处理的对照组;划痕实验结果显示HC6R1能够显著抑制肝癌细胞的迁移,粘附实验和Transwell实验发现HC6R1能够显著抑制肝癌细胞的粘附和侵袭能力。2.2.利用肝癌细胞对小鼠体内成瘤实验发现,HC6R1可以抑制小鼠皮下肿瘤的生长;同时可以抑制原位成瘤小鼠肿瘤的生长并有效延长原位成瘤小鼠的生存时间。2.3通过检测细胞凋亡和细胞周期发现,HC6R1可以促进肝癌细胞细胞的凋亡,并且能够将细胞周期阻滞在G1/S期,从而抑制肿瘤细胞的增殖。利用基因芯片技术检测HC6R1作用的靶基因发现Bcl-2,Bcl-x L,Survivin,Myc,Cyclin D1,VEFG,HIF-1,MMP-2,IL-6和IL-10基因显著活化,其中大部分基因是STAT3信号通路的下游基因。通过Western blotting检测其靶向基因的蛋白质表达水平发现HC6R1抗体可以下调HepG2和Huh7细胞p-STAT3、CyclinD1和CDK4的基因表达水平。结论:1.HC6R1能够特异性识别人肝癌细胞和组织,其作用位点为IL6R。2.HC6R1能够显著抑制肝癌细胞的增殖、迁移、粘附及侵袭。3.HC6R1可以显著抑制小鼠肿瘤的生长并延长小鼠的生存时间。4.HC6R1可以阻断IL6介导的JAK/STAT3信号通路,通过抑制其下游STAT3蛋白的磷酸化阻滞G1期细胞周期蛋白CyclinD1和CDK4的表达从而将细胞周期抑制在G1/S期并促进细胞凋亡。