论文部分内容阅读
本研究以新扬州鸡为研究对象,根据已发表的基因序列设计引物,利用逆转录多聚酶链反应等分子生物学技术进行了新扬州鸡降钙素、甲状旁腺激素和D28k钙结合蛋白等三个主要钙代谢调节物基因cDNA的扩增与真核表达质粒的构建,并通过腿部肌肉注射导入构建质粒,测定血清中降钙素、甲状旁腺激素、雌二醇浓度及血钙、血磷的浓度,以观察真核表达质粒在鸡体内的表达效果,不仅为今后从事鸡体内钙营养代谢调控机制的研究提供了必要的物质条件与技术手段,同时也为鸡育种过程中钙代谢调节相关基因研究及应用基因增强疗法治疗鸡钙代谢性疾病提供了重要的基础材料。 1.钙代谢调节相关基因的克隆与测序 将取自四只450日龄新扬州鸡的新鲜鳃后腺、甲状旁腺和小肠粘膜上皮组织提取总RNA后,利用新设计的引物通过逆转录多聚酶链反应进行扩增,并对扩增得到的产物进行了酶切鉴定与序列分析。结果: ①用SV Total RNA Isolation System从前述三个组织样品中提取得到了总RNA,以此为模板,用本研究设计的引物通过RT-PCR扩增得到降钙素基因417bp、甲状旁腺素基因360bp和D28k钙结合蛋白基因800bp三个片段。 ②将得到的基因cDNA分别导入pGEM-T载体、PCR鉴定、测序,将序列分析的结果利用Blast程序与已发表的核苷酸序列进行比对。结果表明:本研究扩增得到的新扬州鸡降钙素cDNA核苷酸序列中仅有一个碱基与目前已发表的鸡降钙素基因cDNA不同;甲状旁腺激素基因cDNA则与GenBank记录鸡甲状旁腺激素基因完全一致;D28k钙结合蛋白基因cDNA与已发表的核苷酸序列也有一个碱基的差别。 ③根据核苷酸序列分析结果推导出的氨基酸序列结果表明:新扬州鸡降钙素及甲状旁腺激素的氨基酸序列与已发表的鸡相应激素的氨基酸序列完全一致,并没有因为降钙素基因cDNA核苷酸序列中一个碱基的差异而带来降钙素氨基酸序列的改变。但D28k钙结合蛋白却因+760处的G转换成了T,相应的引起了第252位的缬氨酸转变为了色氨酸。 ④三个物质氨基酸序列的动物种属同源性比较结果为:在所列10种降钙素的氨基酸序列中,不同种属间氨基酸的保守序列所占比例为75%。本研究扩增得到的降钙