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1 研究背景自身免疫性甲状腺炎是一类免疫系统疾病,是导致甲状腺功能减退的常见原因,同时也是引起甲状腺乳头状癌癌前病变的重要原因,目前西医多采用对症处理,尚缺乏有效阻止病情进展且不良反应小的药物进行治疗。中药夏枯草治疗自身免疫性甲状腺炎已有相关临床报道和机制探索,但临床报道多为单中心,小样本研究,无法为临床提供高质量的循证医学证据,且机制探索多围绕抗炎作用和免疫调节作用进行论述,无法形成完善的证据体系。基于此,本研究首先应用系统评价的方法整合现有的临床数据,论证了中药夏枯草治疗自身免疫性甲状腺炎的临床疗效,证明其安全有效;其次应用网络药理学的方法找到了夏枯草的主要成分和作用于疾病的核心基因,并运用分子对接的方法进行了验证,分析了其可能理论机制;最后根据网络药理学的结果,设立了动物实验,进一步讨论夏枯草对自身免疫性甲状腺炎大鼠免疫调节和甲状腺细胞凋亡方面的作用,充实了中药夏枯草治疗自身免疫性甲状腺炎的理论体系,反证了临床治疗的有效性。本课题分为系统评价、网络药理学和实验研究三部分。2 研究目的2.1系统评价夏枯草治疗自身免疫性甲状腺炎的临床疗效和不良反应。2.2采用网络药理学方法探究夏枯草治疗自身免疫性甲状腺炎可能的药理作用机制。2.3应用动物实验的方法,评价夏枯草治疗自身免疫性甲状腺炎大鼠疗效,并从免疫调节和细胞凋亡方面对其作用机制进行探索。3 研究方法3.1夏枯草制剂治疗自身免疫性甲状腺炎的系统评价运用Cochrane协作网工作手册来制定检索策略并进行文献质量评价。全面检索四大中文数据库VIP、CNKI、WANFANG、CBM和四大英文数据库PubMed、Cochrane library、Embase、SCI。中文检索词包括“自身免疫性甲状腺炎、慢性淋巴细胞性甲状腺炎、桥本甲状腺炎”,“夏枯草”、“随机对照”等,英文检索词包括“Thyroiditis,Autoimmune”、“Thyroiditis,Lymphocytic”、“Prunella”、“Randomized Controlled Trial”等,检索从建库到2022年2月3日前发表的夏枯草治疗自身免疫性甲状腺炎的随机对照试验。按照纳入标准与排除标准对文献进行筛选、数据提取和偏倚风险评估,并用Revman 5.3软件对相关结局指标进行统计分析。3.2基于网络药理学探讨夏枯草治疗自身免疫性甲状腺炎机制研究检索中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）,根据OB≥30%和DL≥0.18来筛选夏枯草有效成分和作用靶点,并运用Uniport数据库将靶点信息标准化。通过GeneCards、OMIM和PharmGkb数据库获得自身免疫性甲状腺炎的相关靶点基因,使用R软件筛选药物和疾病的交集靶点,并用Cytoscape软件构建“药物-成份-疾病-靶点”网络图,通过String平台将获得的交集靶点进行蛋白质相互作用网络分析（PPI）,并根据CytoNCA打分和degree值获得最终的核心基因,同时将获得的交集靶点进行GO和KEGG富集分析。最后通过分子对接技术将夏枯草核心活性成分与自身免疫性甲状腺炎核心基因进行对接。3.3探讨夏枯草对自身免疫性甲状腺炎大鼠免疫调节机制和细胞凋亡机制的影响60只SPF级雌性SD大鼠按随机数表法随机分为正常组、模型对照组、硒酵母组及夏枯草低、中、高剂量组,每组10只。采用高碘水（NaI）喂养联合皮下注射猪甲状腺球蛋白（pTg）与弗氏佐剂（CFA、IFA）诱导AIT大鼠模型,造模后连续灌胃给药4周。实验过程中动态观察大鼠状态,包括一般情况和行为学情况,实验结束后取大鼠血清、甲状腺组织,酶联免疫吸附法（ELISA）检测大鼠血清 FT3、FT4、TSH、TPOAb、TGAb、INF-γ、IL-10、IL-17和IL-35含量,HE染色以光镜观察大鼠甲状腺组织病理学改变,流式法检测大鼠外周血中Th1、Th2、Th17和Treg细胞含量,qPCR检测甲状腺组织中JNK、p38MAPK基因表达量,Western blot检测甲状腺组织中P-JNK、P-p38MAPK蛋白含量,免疫组化法观察大鼠甲状腺组织Bcl-2 和 Caspase-3 表达。4 研究结果4.1夏枯草制剂治疗自身免疫性甲状腺炎的系统评价共纳入16项研究。Meta分析结果显示:夏枯草治疗自身免疫性甲状腺炎的总有效率明显高于常规治疗组[RR=1.20,95%CI（1.15,1.25）,P＜0.00001]。在甲状腺过氧化物酶抗体TPOAb和甲状腺球蛋白抗体TGAb改善上分别优于常规治疗组[SMD=-1.53,95%CI（-2.32,-0.74）,P=0.0002;SMD=-1.91,95%CI（-2.91,-0.91）,P=0.0002]。在减小甲状腺体积方面明显优于常规治疗组[甲状腺右侧叶厚度WMD=-0.28,95%CI（-0.47,-0.08）,P=0.005;甲状腺左侧叶厚度 WMD=-0.27,95%CI（-0.49,-0.05）,P=0.02;甲状腺峡部厚度 WMD=-0.12,95%CI（-0.14,-0.10）,P＜0.00001]。在降低Th17/CD4+T上明显优于常规治疗组[WMD=-1.31,95%CI（-1.50,-1.13）,P＜0.00001]。而在不良反应发生率方面夏枯草组与常规治疗组相当[RR=1.10,95%CI（0.49,2.49）,P=0.82]。同时根据总有效率漏斗图提示偏倚可控。4.2基于网络药理学探讨夏枯草治疗自身免疫性甲状腺炎机制研究从TCMSP数据库中获取槲皮素、木犀草素等11种有效活性成分,经Uniport数据库注释后共获得夏枯草不重复作用靶点170个,经检索三大基因数据库后,获得自身免疫性甲状腺炎相关基因5014个,通过构建药物和疾病交集靶点网络,共获得交集靶点143个,进行PPI分析,根据CytoNCA插件打分,共获得JUN、MAPK1等核心基因13个。将获得的143个交集靶点进行GO和KEGG富集分析,GO富集分析显示生物过程2284个,细胞成分46个,分子功能161个,KEGG富集分析显示信号通路172条。富集分析显示,夏枯草可通过抑制炎症、免疫调节和细胞凋亡等多个通路对自身免疫性甲状腺炎产生治疗作用。将JUN、MAPK1核心基因对应蛋白与夏枯草槲皮素、木犀草素进行分子对接,对接结果证明两者间有高效的亲和性。4.3探讨夏枯草对自身免疫性甲状腺炎大鼠免疫调节机制和细胞凋亡机制的影响①实验中造模大鼠血清TPOAb和TGAb明显升高,且甲状腺组织中可见淋巴细胞浸润,提示自身免疫性甲状腺炎大鼠模型制造成功。②与正常组比较,模型对照组大鼠血清FT3、FT4、TPOAb、TGAb、IFN-γ、IL-17水平显著升高（P＜0.05）,而TSH、IL-10、IL-35水平均显著降低（P＜0.05）。与模型对照组比较,夏枯草各剂量组和硒酵母组FT3、FT4、TPOAb、TGAb、IFN-γ、IL-17 水平明显降低（P＜0.05）,而 TSH、IL-10、IL-35水平明显升高（P＜0.05）,且夏枯草的疗效呈剂量依赖性。与硒酵母组比较,夏枯草高剂量组对FT3、FT4、TSH、TPOAb、TGAb改善更优（P＜0.05）,夏枯草中、高剂量组对IFN-γ、IL-17、IL-10、IL-35改善更优（P＜0.05）。③光镜下正常组可见甲状腺结构完整,滤泡胶质饱满充盈,上皮细胞规则,无淋巴细胞浸润。与正常组比较,模型对照组大鼠甲状腺滤泡细胞破坏,胶质成分丢失,大量淋巴细胞浸润。与模型对照组比较,夏枯草各剂量组和硒酵母组甲状腺结构恢复,滤泡细胞排列规则,仅少许淋巴细胞浸润,且恢复程度与夏枯草剂量有关。与硒酵母组比较,夏枯草中、高剂量组对滤泡破坏及淋巴细胞浸润改善更优。④与正常组比较,模型对照组大鼠血清Th1、Th17、Th1/Th2、Th17/Treg水平明显升高（P＜0.05）,而Th2、Treg水平明显降低（P＜0.05）。与模型对照组比较,夏枯草各剂量组和硒酵母组Th1、Th17、Th1/Th2、Th17/Treg水平显著降低（P＜0.05）,而Th2、Treg水平显著升高（P＜0.05）,且夏枯草的疗效呈剂量依赖性。与硒酵母组比较,夏枯草各剂量组对Th1、Th2、Th17/Treg改善更优（P＜0.05）,夏枯草中、高剂量组对Treg改善更优（P＜0.05）。⑤与正常组比较,模型对照组JNK、p38MAPK基因表达量明显增高（P＜0.05）。与模型对照组比较,夏枯草各剂量组和硒酵母组JNK、p38MAPK基因表达量均出现降低（P＜0.05）。与硒酵母组比较,夏枯草中、高剂量组对JNK、p38MAPK改善更优（P＜0.05）。⑥与正常组比较,模型对照组P-JNK/Total JNK、P-p38MAPK/Total MAPK 比例明显增高（P＜0.05）。与模型对照组比较,夏枯草各剂量组和硒酵母组 P-JNK/Total JNK、P-p38MAPK/Total MAPK 比例明显降低（P＜0.05）。与硒酵母组比较,夏枯草中、高剂量组对P-JNK/Total JNK、P-p38MAPK/Total MAPK 改善更优（P＜0.05）。⑦与正常组比较,模型对照组Bcl-2明显降低（P＜0.05）,Caspase-3明显增加（P＜0.05）。与模型对照组比较,夏枯草各剂量组和硒酵母组Bcl-2显著增加（P＜0.05）,Caspase-3显著降低（P＜0.05）。与硒酵母组比较,夏枯草高剂量组对Bcl-2改善更优（P＜0.05）,夏枯草中、高剂量组对Caspase-3改善更优（P＜0.05）。5 研究结论5.1夏枯草治疗自身免疫性甲状腺炎疗效显著,能降低自身抗体水平,减小甲状腺体积,降低Th17/CD4+T,且不良反应小,具有免疫调节作用。5.2夏枯草能够通过多成分、多靶点、多通路治疗自身免疫性甲状腺炎,JUN、MAPK1为其主要核心基因,且分子对接验证结果可信。5.3本实验成功制造出了自身免疫性甲状腺炎大鼠模型,并发现其大鼠体内存在 Th1、Th17、Th1/Th2、Th17/Treg、IFN-γ、IL-17 等促炎因子上调和Th2、Treg、IL-10、IL-35等抑炎因子下调,同时通过提升JNK、p38MAPK、P-JNK、P-p38MAPK 含量,抑制 Bcl-2 表达,促进 Caspase-3表达,来使甲状腺淋巴细胞浸润,滤泡细胞凋亡,进一步导致了 TPOAb和TGAb的升高及甲状腺功能的改变。夏枯草胶囊可以改善自身免疫性甲状腺炎模型大鼠的一般生理状态,降低促炎因子Th1、Th17、Th1/Th2、Th17/Treg、IFN-γ、IL-17 水平,升高抑炎因子 Th2、Treg、IL-10、IL-35水平,通过降低 JNK、p38MAPK、P-JNK、P-p38MAPK 含量,增加 Bcl-2表达,减少Caspase-3表达,来减轻模型大鼠甲状腺淋巴细胞浸润和滤泡细胞破坏,其能降低TPOAb和TGAb水平,改善甲状腺功能,并有剂量依赖的特点。