第一部分薯蓣皂苷经5-LO/LTB4途径对TNF-α诱导FLS损伤的保护作用及机制研究背景和目的:类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节滑膜异常增生为主要特征的自身免疫疾病。滑膜异常增生与滑膜细胞的凋亡和增殖失衡有关,其中成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLS)作为血管翳形成的主要细胞,由于凋亡不足积极参与RA的进程。RA患者FLS的特征是呈肿瘤样扩张,在血管翳形成、软骨和骨侵蚀中具有中心作用。肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor alpha,TNF-α)产生于RA免疫反应的早期,能够诱导体内很多细胞产生炎性细胞因子白细胞介素-6(Interleukin 6,IL-6)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)、白细胞介素-8(Interleukin 8,IL-8)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、环氧合酶-2(Cyclooxygenase 2,COX-2)、基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMP)等,促进滑膜增生,参与RA等炎症免疫反应。薯蓣皂苷(Dioscin,Dio)具有调节免疫、抗炎、抗肿瘤、抗血小板聚集等多种药理作用,表明了其广阔的应用前景。本实验我们采取TNF-α体外诱导FLS作为RA的离体模型,探索Dio对TNF-α诱导Ⅱ型胶原诱导的关节炎模型(CollagenⅡinduced arthritis,CIA)大鼠FLS(RAFLS)的治疗作用及其机制。方法:1.将0ng/ml、1.25ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、160ng/ml TNF-α与RAFLS共同孵育24h、48h、72h,MTT法检测细胞存活率,确定TNF-α诱导RAFLS的最佳浓度和时间。2.将0.5μg/ml、1μg/ml、1.5μg/ml、2μg/ml、2.5μg/ml、3μg/ml、3.5μg/ml、4μg/ml、4.5μg/ml、5μg/ml Dio与TNF-α诱导的RAFLS共同孵育24h、48h、72h检测细胞存活率,确定Dio对TNF-α诱导RAFLS作用的合适浓度和时间。3.ELISA检测对照组、TNF-α模型组、Dio 1μg/ml组、Dio 2μg/ml组、Dio3μg/ml组、Dio 4μg/ml组细胞培养上清中白三烯B4(Leukotriene B4,LTB4)含量的变化。4.实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative transcription polymerase chain reaction,Q-PCR)检测对照组、TNF-α模型组、Dio 1μg/ml组、Dio 2μg/ml组、Dio 3μg/ml组、Dio 4μg/ml组细胞中5-脂氧酶(5-lipoxygenase,5-LO)、白三烯A4水解酶(Leukotriene A4 hydrolase,LTA4H)、白三烯B4受体1(Leukotriene B4 receptor 1,BLT1)、白三烯B4受体2(Leukotriene B4 receptor 1,BLT2)m RNA的表达变化。5.蛋白印迹检测对照组、TNF-α模型组、Dio 1μg/ml组、Dio 2μg/ml组、Dio3μg/ml组、Dio 4μg/ml组细胞中5-LO、LTA4H蛋白的表达变化。6.免疫荧光检测对照组、TNF-α模型组、Dio 1μg/ml组、Dio 2μg/ml组、Dio3μg/ml组、Dio 4μg/ml组细胞中LTA4H蛋白的表达变化。结果:1.与对照组相比,2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml剂量组TNF-α与RAFLS共同孵育24h、48h、72h均能显著提高细胞的存活率,且10ng/ml剂量组TNF-α处理组RAFLS增殖促进作用最为明显(p<0.05)。综合考虑,以后的实验我们选用终浓度为10ng/ml TNF-α处理24h制作细胞模型。2.与TNF-α模型组相比,1μg/ml、1.5μg/ml、2μg/ml、2.5μg/ml、3μg/ml、3.5μg/ml、4μg/ml、4.5μg/ml、5μg/ml剂量组Dio能够时间剂量依赖性的抑制TNF-α诱导的RAFLS的增殖(p<0.05)。3μg/ml剂量组Dio作用于RAFLS 24h后,细胞存活率达到49.46±1.33,接近50%。综合考虑,后续实验我们选用1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml剂量组Dio处理TNF-α诱导的RAFLS,作用24h。3.与对照组相比,RAFLS经TNF-α诱导后,培养上清中LTB4含量明显升高,Dio能剂量依赖的降低TNF-α引起的LTB4含量的升高(p<0.05)。4.与对照组相比,RAFLS经TNF-α诱导后,细胞中5-LO和LTA4H m RNA和蛋白表达明显升高(p<0.05)。与TNF-α模型组相比,1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml Dio剂量组细胞5-LO和LTA4H m RNA和蛋白表达明显降低(p<0.05)。5.与对照组相比,RAFLS经TNF-α诱导后,细胞中BLT1和BLT2 m RNA表达明显升高,1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml剂量组Dio能显著降低TNF-α模型细胞中BLT1和BLT2 m RNA表达,4μg/ml剂量组Dio能显著降低FLS中BLT2 m RNA表达(p<0.05)。结论:1.10ng/ml TNF-α与RAFLS共同孵育24h,可以显著促进RAFLS的增殖,故选择此浓度作用24小时制作离体RA疾病模型。2.1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml的Dio与TNF-α诱导的RAFLS共同孵育24h,能显著抑制RAFLS细胞的增殖,提示其对TNF-α引起的RAFLS损伤具有保护作用。3.Dio可以降低TNF-α诱导的RAFLS培养上清中LTB4的含量,这可能与其对FLS损伤的保护作用有关。4.Dio可能通过下调TNF-α诱导的RAFLS中LTB4合成酶系5-LO和LTA4H表达,降低上清中LTB4的含量。5.Dio可以降低TNF-α诱导的RAFLS LTB4受体BLT1和BLT2的表达,阻碍LTB4下游通路,发挥对TNF-α诱导的RAFLS损伤的治疗作用。第二部分薯蓣皂苷经5-LO/LTB4途径治疗CIA小鼠的作用及机制研究背景和目的:RA是一种以关节滑膜炎为主要特征的常见的自身免疫病。临床患者表现为关节晨僵、肿胀、畸形,甚至功能丧失、残疾等,严重影响患者的生活质量。CIA模型是与RA临床发病最为相似的动物模型,是RA实验研究的常用动物模型。中医学认为薯蓣皂苷具有“消食利水,舒筋活血,祛痰,截疟”的功效,现代研究证实薯蓣皂苷具有调节免疫、抗炎、抗肿瘤、改善心血管功等多种药理作用,是一种潜在的治疗RA的中药。本实验拟应用牛Ⅱ型胶原诱导的CIA小鼠模型,从整体动物水平研究薯蓣皂苷片(Dioscornin tablets,DT)对RA的治疗作用,并探讨其分子机制。方法:1.雄性昆明系小鼠(6-8周龄),体重25±2g,随机分为对照组、CIA小鼠模型组和DT 5个剂量组:15.6 mg/(kg·d)、31.2 mg/(kg·d)、62.4 mg/(kg·d)、124.8mg/(kg·d)、249.6 mg/(kg·d),每组12只。于初次免疫d21,对照组和模型组给予生理盐水灌胃,用药组给予不同剂量的DT灌胃,观察DT对CIA模型小鼠体重、关节指数、足爪肿胀程度、胸腺和脾脏指数、脾脏和滑膜病理损伤的影响。2.ELISA检测对照组,CIA模型组,低、中、高DT组小鼠血清中LTB4含量变化。3.反转录PCR(RT-PCR)检测对照组,CIA模型组,低、中、高DT组小鼠脾脏中5-LO、LTA4H、BLT1、BLT2 m RNA表达的变化。4.蛋白印迹和免疫组化检测对照组,CIA模型组,低、中、高DT组小鼠脾脏中5-LO、LTA4H蛋白的表达变化。结果:1.与对照组相比,CIA模型组小鼠体重、关节指数、关节肿胀度以及胸腺指数和脾脏指数明显高于对照组(p<0.05)。与CIA模型组相比,灌胃治疗12天后31.2 mg/(kg·d)、62.4 mg/(kg·d)、124.8mg/(kg·d)DT剂量组小鼠体重、关节指数和关节肿胀度有不同程度的降低,灌胃治疗21天后小鼠的脾脏指数均不同程度的降低(p<0.05)。灌胃治疗21天后62.4 mg/(kg·d)各DT剂量组小鼠胸腺指数显著降低(p<0.05),脾脏病理损伤和踝关节病理损伤明显改善。2.与对照组相比,CIA模型组小鼠血清中LTB4的含量明显升高,而不同剂量组DT均能显著的降低CIA小鼠血清中LTB4含量(p<0.05)。3.与对照组相比,CIA模型组小鼠脾脏中LTA4H和5-LO m RNA和蛋白的表达明显升高(p<0.05),而DT低、中、高组剂量均能显著的降低CIA小鼠脾脏中5-LO和LTA4H蛋白的表达,DT低、中组剂量能显著的降低CIA小鼠脾脏中5-LO m RNA的表达(p<0.05)。4.与对照组相比,CIA模型组小鼠脾脏中BLT1和BLT2 m RNA表达明显升高,DT低、中组剂量能显著的降低CIA小鼠脾脏中BLT1 m RNA表达,低、中、高剂量DT均能显著降低CIA小鼠脾脏中BLT2 m RNA表达(p<0.05)。结论:1.31.2 mg/(kg·d)、62.4 mg/(kg·d)、124.8mg/(kg·d)剂量组DT可明显降低CIA小鼠体重、关节指数、关节肿胀度以及胸腺指数、脾脏指数,并且可明显改善小鼠胸腺和脾脏病理损伤,因此对CIA小鼠有治疗作用。2.CIA模型组小鼠血清中LTB4的含量明显升高,不同剂量组DT均可显著降低CIA小鼠血清中LTB4的含量,表明LTB4异常增加可能与RA发病有关,而DT对CIA小鼠的治疗作用可能涉及其对LTB4含量的降低。3.DT通过降低CIA小鼠LTB4合成酶系5-LO和LTA4H的表达降低CIA小鼠血清中LTB4的含量。4.DT可以通过降低CIA小鼠脾脏中LTB4受体BLT1和BLT2的表达,阻碍LTB4发挥作用。