抗菌肽作为可能的抗生素替代剂，正受到越来越多的重视。家蚕抗菌肽Cecropin B属于典型的Cecropin族抗菌肽，可以形成两亲α螺旋构象，主要是通过提高细菌细胞膜的通透性，使细胞内容物外泄的机制来杀菌。Thanatin是迄今为止所发现的抗菌活性最强的昆虫抗菌肽，不仅对革兰氏阳性及阴性细菌，而且对真菌也有杀灭作用。Thanatin含有两个Cys残基，可形成分子内二硫键，在抗菌肽分子的C端有由两个反向β折叠片构成的电子穴结构。Thanatin可能通过抑制细菌呼吸的机制起作用。 本研究以LPS诱导化蛹第3天的健康家蚕蛹，并以RT-PCR的方法克隆编码CecropinB成熟肽的家蚕Cecropin B基因。测序结果与报道序列完全一致。以搭桥PCR的方法人工合成Thanatin基因。并对两种抗菌肽进行了高效GST融合表达，SDS-PAGE结果显示，表达的融合蛋白占细菌总蛋白的22％以上。琼脂孔穴抑菌试验表明，在高浓度下，融合蛋白具有部分抗菌活性。 抗菌蛋白由于分子小，在生物组织中含量少，分离获得大量天然产物困难很大，而人工合成成本高，因此对抗菌肽的活性测定较困难。利用抗菌肽GST融合蛋白仍有部分抗菌肽活性，而表达宿主菌-大肠杆菌对抗菌肽具有内源敏感性，融合蛋白的表达可造成宿主菌“自杀”的现象，以家蚕Cecropin B为昆虫抗菌肽的代表基因，建立基于GST融合表达的，灵敏、简便的抗菌肽体内测活系统。并对宿主菌种类、诱导剂浓度、诱导起始菌浓度等方面对系统进行优化。在宿主菌为JM109，诱导剂IPTG浓度为0.5mMol/L，诱导起始菌浓度控制在OD₆₁₀=0.1～0.2时，可以从细菌生长曲线的抑制程度分析抗菌肽的活性。 对Thanatin N端截短类似物的活性研究表明，N端长臂区的突变对抗菌肽生物活性的影响，相对于C端的突变来说是温和的。设计合成Thanatin N端突变体Thanatin”（V6G/I8R/I9S），和在Thanatin的第4位残基后插入突变肽段Pro-Gly-Pro-Arg-Ser-Tyr而形成的Thanatin类似物Thanatin’。并利用体内活性检测系统对Thanatin’和Thanatin”的抗菌活性进行了分析。用极性残基替换Thanatin N端长臂区的非极性残基（V6G/I8R/I9S）后，虽然导致Thanatin疏水核发生改变，N端长臂区原有的Pro7，Ile8，Ile9疏水带消失，C端Arg20残基带正电荷的侧链不能埋藏于由Pro7和Ile9侧链组成的疏水带中而表露，这种突变可能会增加主链的旋转性。但从体内活性的检测结果看，这种突浙江大学博士学位论文变对活性没有大影响，这与几即chi的结果是一致的，说明这种带正电荷的侧链埋藏于疏水域中的构象并非活性必需的，而与Mand耐（1 998）的推论不同。 在类似物Thanatin’中，由于插入序列Pro一Val一Pro一Ile一Ile.T”的影响导致分子3级结构发生较大的变化，两个p片的长度缩短，连接两个p片的肤链发生扭曲，分子C末端活性残基在分子中的位置发生改变，抗菌活性部分丧失。 由于抗菌肤CecropinB和Thanatin分属不同的抗菌肤类型，其作用机制也完全不同，在体内抑菌曲线上也表现不同。CecropinB的体内抑菌曲线表现为缓慢增长，而Thanatin则表现为诱导早期细菌生长较好，中后期细菌浓度下降的特点，这与两种抗菌肤的作用机制是一致的。 以家蚕抗菌肤CecropinB和Thanatin为基础，利用计算机辅助设计，合成了10个N端为CeeropinB两亲螺旋序列，C端为Thanatin双反向p折叠片序列，中间以连接序列相连的杂合抗菌肤。利用体内活性检测系统对10种杂合肤进行活性筛选，得到CB一Thb，CB一The，CB一Th。和CB一Thg四种活性较强的杂合肤。对杂合肤CB一The进行高效GST融合表达，用GST亲和层析纯化融合蛋白，以肠激酶酶切融合蛋白，分子筛部分纯化非融合的杂合肤CB一The，分析其体外抗菌活性。结果表明，其活性介于两个亲本抗菌肤之间。 利用体内活性检测系统，比较分析了杂合肤CB一The和亲本抗菌肤CeeroPinB、Thanatin的抑菌曲线，结果表明杂合肤Cec一The的抗菌活性介于两个亲本之间，这与体外活性检测结果一致。比较3种表达细菌的生长曲线，杂合肤Cec一The和Thanatin表达菌的曲线形态相似。杂合肤Cec一The的细菌浓度在诱导早期与cecropinB相似，而比Thanatin低，在诱导中期，出现细菌浓度的下降。暗示着杂合肤兼有两亲本抗菌肤的抗菌机制。