二色补血草(Limoniumbicolor),白花丹科补血草属,为典型的泌盐盐生植物,是研究盐生植物耐盐机理的模式植物。二色补血草生活周期比较长,需要越过寒冷的冬季,第二年开花结实,这给研究带来很大的不便,所以亟待缩短其生活史,最重要的是掌握其春化条件和光周期参数。本实验室冯中涛通过离子注入法获得两株二色补血草早花突变体(2015),该早花突变体能够不经过冬天的低温,在当年完成开花结实,但是,该早花突变体早花原因尚不清楚。本论文第一部分对野生型二色补血草开花所需的春化条件进行探究。第二部分对早花突变体的春化条件及开花相关性状进行初步探究。以下是研究的主要结果:1.野生型二色补血草种子春化时间的探究。未经提前吸胀处理的野生型二色补血草种子在4℃低温下春化0、3、6、7、10、15、20天,结果发现,春化处理15天的植株抽薹时间最早,随着种子春化时间的延长,开花率呈逐渐上升的趋势,但整体上来看,抽薹开花所需时间较长,最快的植株抽薹时间达到229天,开花率也偏低,最高的开花率只有50%。2.野生型二色补血草种子春化吸胀时间和温度的探究。春化前,分别进行0、15、30小时(分别代表未吸胀、代谢活跃期、萌发后期)的吸胀处理,吸胀完成后,将每个处理的种子都分别放入2、4、6℃的低温环境下进行种子春化处理,春化时间定为30天。结果发现,4℃春化的开花率整体上是最高的,其中吸胀15小时最佳,开花率达到83.33%,最早抽薹时间只有136天,为所有处理组的最短时间,所以,将种子春化的温度定为4℃,春化前吸胀时间定为15小时。3.野生型二色补血草幼苗春化时间的探究。将野生型二色补血草6叶期幼苗放入10℃/7℃(白天/夜晚)低温下进行幼苗春化,时间定为25天和35天。结果发现,幼苗春化35天的植株开花率达到100%,最早抽薹时间为168天,幼苗春化25天的植株开花率达到75%,最早抽薹时间为173天,所以野生型二色补血草以10℃幼苗春化35天能达到开花所需春化条件。4.二色补血草早花突变体早花性状的验证。首先对二色补血草WT、B15和D6的种子在4℃进行30天的种子春化,种子春化完成后,于同一天播种春化和未经种子春化处理的二色补血草种子。待二色补血草幼苗生长到4叶期,开始对未经春化处理的二色补血草WT、B15和D6植株进行幼苗春化(白天温度8℃,夜晚温度4℃),幼苗春化时间定为30、20、10天,并于同一天完成幼苗春化处理,共15个处理。结果发现,幼苗春化的植株开花率均达到100%,说明在8℃低温下,幼苗春化10天即能达到春化条件。种子春化植株,当突变体B15的开花率达到80%,D6的开花率达到60%时,WT的开花率为40%。未经春化的植株,突变体B15的开花率达到60%, D6的开花率达到40%,而WT植株开花率为0。以上现象说明突变体的早花现象是可以遗传的,且种子春化条件下,早花比例在75%左右,大致符合孟德尔定律3:1的性状分离比,但未春化条件下,早花性状的比例要低于75%,需要进一步种植F2代验证。5.早花突变体早花原因的探究。开花需要能量和物质的积累,未经春化处理的早花突变体B15和D6在抽薹期植株内可溶性糖含量和可溶性蛋白含量均显著高于野生型植株;测定植株叶片内激素时发现抽薹的突变体植株叶片内GA3含量明显高于未抽薹的野生型植株,而ABA含量显著低于未抽薹的野生型植株。大量研究表明,GA3对开花有促进作用,ABA对开花有抑制作用。突变体激素的改变可能是引起早花的原因。6.早花突变体生殖发育的变化。在进行激素测定时,我们发现,突变体植株叶片内BR的含量显著低于野生型植株,野生型植株叶片内BR含量是突变体B15的1.6倍,BR与植物雄蕊的发育密切相关,对突变体雄蕊发育进行观察,发现突变体的花药内花粉数量、有活力花粉所占比例和结实率都低于野生型,突变体所结种子的大小和千粒重也均显著低于野生型,说明突变体BR含量的降低影响花粉的发育,导致结实率的降低和种子的重量的下降。7.早花突变体晚萌发现象的探究。在对种子进行低温春化处理时,偶然发现突变体B15和D6种子在低温下的萌发时间要显著晚于野生型。通过预实验我们发现野生型种子在4℃低温春化时,第14天开始有萌发的趋势,于是,在此时期测定野生型和突变体种子内激素含量,发现突变体种子内油菜素内酯含量显著低于野生型,野生型种子内油菜素内酯的含量是B15的2.8倍,研究发现BR能够促进种子萌发,这可能是突变体种子晚萌发的原因。8.外源BR对二色补血草种子萌发的影响。在4℃低温萌发时,对种子外施BR,发现BR对野生型种子的萌发促进作用显著,而对突变体种子的萌发无显著影响。常温(25℃)萌发时,发现BR对野生型和突变体种子的萌发均有促进作用,但对野生型种子的萌发促进作用更强。通过查阅文献,我们发现低温下BR能够促进GA3含量的上升,从而促进α-淀粉酶活性升高,促进淀粉分解为葡萄糖,为萌发提供能量,促进萌发,于是在低温(4℃)萌发条件下外施GA3,发现GA3能够使突变体萌发率恢复到WT的水平。说明突变体种子可能在两个方面的突变影响种子的萌发,一方面是BR含量低,对萌发促进作用弱,另一方面是BR对GA促进作用的信号转导途径可能受到影响,这种影响是温度依赖性的,其详细机制需要进一步探究。9.突变体BR合成关键基因表达量的测定。在种子低温萌发14天时测定BR合成关键基因的表达量,结果表明突变体B15种子内BR合成关键基因DWF1和CPD的表达量显著低于野生型,只有野生型的0.55和0.44倍。这说明离子注入导致突变体B15种子中DWF1和CPD基因的表达受到影响,进而影响BR的合成,导致种子萌发过程中BR含量降低,对萌发的促进作用减弱,进而导致晚萌发的性状。在基因水平上解释突变体BR含量降低和种子晚萌发的原因。