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木聚糖是自然界存在的可再生的一种植物成分。木聚糖酶能降解木聚糖成木糖或木寡糖,在饲料、造纸、食品以及能源工业中有着广泛的用途。木聚糖酶及木聚糖酶基因的研究是当前酶学研究热点之一。目前主要集中在高产菌株的选育及木聚糖酶基因的克隆和表达研究上。本研究对黑曲霉MC062的木聚糖酶基因进行了克隆与酿酒酵母表达。主要研究结果如下:
从真菌黑曲霉中提取mRNA合成cDNA的第一条链,用PCR方法扩增得到一个编码endo—β—1,4—xylanase的基因——XYN7。利用简便的RT—PCR方法克隆的木聚糖酶基因属于G/11家族。该cDNA序列与南非和波兰科学家克隆到的序列非常相似。
cDNA片段的核酸序列含有一个631bp的开放阅读框,编码210个氨基酸残基。来源于黑曲霉的编码木聚糖酶基因XYN7被克隆并在酿酒酵母INVSc1中表达。XYN7基因构建在多拷贝穿梭载体pYES6/CT上,在GALI启动子和CYC1转录终止信号的控制下成功在酿酒酵母中表达。半乳糖诱导24h时重组蛋白的表达量最大,酶活可达62.5IU/mL。
酿酒酵母INVSc1中高效表达的重组酶最适温度为55℃,可有效地结合并水解可溶性木聚糖。该木聚糖酶对硬木和谷物类木聚塘均有高水解活性。最适pH为3.5,但在很宽的pH范围内都有活性。酶可被CO2+完全抑制,浓度为10 mM/L Fe3+,Zn2+和Mg2+可对酶产生较强的抑制(残余的活性分别为31.9%,41.2%和51.4%),Mn2+能产生弱的激活作用。SDS是酶的强抑制剂。反应混合液中添加抗坏血酸可对酶产生极大激活作用。